猪圆环病毒3型病毒样颗粒制备及诊断方法的建立.pdfVIP

摘 要 猪圆环病毒3 型（PCV3）自2016年在美国首次被发现以来，随后在世界多个国家相继报道， 表明PCV3 已经呈现广泛流行的态势。毫无疑问，这对世界范围内的养猪产业及相关产业造成了 严重的损失，因此，建立有效的PCV3 防控措施刻不容缓。目前研究PCV3 的主要难题是很难从 细胞系中分离出该病毒。然而，通过基于基因工程技术构建的病毒样颗粒 （VLPs）可以揭示病毒 的特征，并且无需分离到病毒即可实现这种目的。基于PCV3VLPs 的研究可能会提供新的思路， 使人们对PCV3病毒有更好的了解，并具有潜在的治疗和诊断价值。 PCV3 的衣壳蛋白（Cap）是其唯一的结构蛋白，也是用于诊断和疫苗开发的重要抗原。本研 究的主要目的是使重组PCV3Cap 蛋白在大肠杆菌中高效表达并自组装成为VLPs，并用于后续诊 断方法的开发。因此设计并合成了5套密码子优化的Cap 基因，包括从临床样品扩增的本实验室 保存野生型PCV3 毒株的Cap 基因（wt-eCap ），3 套基于大肠杆菌密码子偏好完全或部分优化的 重组Cap 基因 （opti-eCap ），以及缺失核定位信号区域 （NLS）的截短Cap 基因 （opti-dCap ）。 随后将这些基因片段插入pET30a 表达载体，重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中表达重组蛋 白。通过SDS分析可得表达opti-eCap-3 的重组蛋白能够在大肠杆菌中高效并且以可溶形 式表达，随后通过透射电子显微镜 （TEM）鉴定纯化的重组蛋白，可以清晰地观察到大量直径 10nm 左右，大小均一的圆形空心颗粒。因此可以确定部分密码子优化的opti-eCap-3 可以在大肠 杆菌中稳定表达并且能够自组装成为VLPs，并以此用于后续诊断方法的开发。在得到高纯度的 PCV3VLPs后，将其用于包被抗原，建立基于VLPs 的血清学诊断方法。经多步试验优化，确定 最佳抗原包被浓度为5µɡ/mL，血清稀释度为1:200，酶标二抗稀释度为1:5000，血清孵育时间为 60min，二抗孵育时间为45min，底物显色时间为 15min。最终建立的间接ELISA 方法具有高度 特异性和敏感性，并成功对373份临床猪血清进行PCV3 抗体检测。最终的结果表明，基于PCV3 VLPs 的间接ELISA 方法将是检测血清样品中PCV3抗体存在的有价值的工具，有助于在临床中 筛查大量的猪血清，提供了一种简便、快捷的诊断方法。 关键字：猪圆环病毒3 型，病毒样颗粒，诊断，猪，间接ELISA 方法 II Abstract Since porcine circovirus type 3 (PCV3) was first found in the United States in 2016, many countries in the world have reported that PCV3 hasbecome widespread.There isno doubt that thishas caused seriouslossestothepig industry andrelated industries aroundtheworld.Therefore,it is of great significance to establish effective PCV3 prevention and control measures.At present, it is difficult to isolate the virus from cell lines. However, virus like particles (VLPs) based on genetic engineering technology can revealthe characteristics ofthevirus, andthispurpose can be achievedwithout isolation of the virus. The research based on PCV3 VLPs may provide new ideas, making people have a better understandingofPCV3,andhavepotentialtherapeuticanddiagnosticvalue.