内质网应激IRE1通路调控伪狂犬病病毒变异株诱发炎症反应的机制研究.pdfVIP

摘 要 猪伪狂犬病病毒 （pseudorabies virus ，PRV ）是一种 α 疱疹病毒，能够引起多种动物及家畜 以发热、奇痒（猪只除外）和脑炎等为主要特征的传染病。2011 年以来，我国出现了PRV 变异 毒株，与经典毒株相比，该毒株能导致更严重的发热、病理损伤和更高的致死率。疱疹病毒感染 能够激活内质网应激，后者通过启动未折叠蛋白反应（UPR ）不同程度地激活下游的蛋白质降解、 自噬、炎症反应等生物学过程。内质网应激作为机体内的一种防御机制，可以介导多种病毒感染 所诱发炎症反应，如其所激活的UPR 会通过其下游转录因子调控多种炎性因子的表达，以达到 宿主清除病原体的目的。而过度的炎性因子表达会诱使宿主发生免疫损伤或严重的发热发病现象。 那么，PRV 变异毒株感染引起的更强的发热和病理损伤的机制是什么？是否是由于内质网应激所 介导炎症反应造成的？为了回答这一问题，本研究对 PRV 经典毒株与变异毒株激活内质网应激 调控炎性因子表达的分子机制进行了研究。 为探究PRV 感染宿主细胞后是否能够诱发炎性因子的表达，本研究通过荧光定量PCR 的方 法，检测了病毒感染PK-15 细胞3、6、12、24、36 h 后IL-6、IL-8、TNF-α 的表达情况。结果显 示，三种炎性因子随着病毒感染时间的延长而呈现逐渐积累的情况，在病毒感染晚期（36 h ），变 异毒株JS-2012 诱发的炎性因子mRNA 及蛋白表达水平均显著高于经典毒株，而两种毒株的生长 曲线并无显著差异。上述结果表明，相比于经典毒株，变异毒株能够更大程度地在体外激活多种 炎性因子的高表达，这种差异是由病毒本身的差异所导致的，与病毒复制速率无关。 为进一步验证内质网应激是否能够调控PRV 感染所引起的炎症反应，本研究首先对PRV 感 染激活内质网应激的程度进行了验证。结果显示 PRV 两种毒株在体外均能够诱导内质网应激标 志蛋白GRP78 的表达，并且激活未折叠蛋白反应（UPR ），不同程度地激活ATF6 、PERK、IRE1 三条通路。其中，经典毒株和变异毒株感染均能够上调PERK 通路中各信号分子的表达，但两种 毒株对各分子的激活程度并无显著差异，表明PRV 经典毒株和变异毒株在对PERK 通路的激活 程度上无差异；随后，我们对ATF6 通路进行验证，结果显示两种毒株感染均能够激活ATF6 的 剪切，但不能够上调其下游信号分子钙网蛋白和钙连蛋白的表达，表明 PRV 两种毒株感染激活 不完整的ATF6 通路；重要的是，相比于经典毒株，变异毒株能够更大程度地激活 IRE1 通路中 IRE1 分子的磷酸化水平以及其下游信号分子XBP1s 、EDEM 的表达，表明PRV 经典毒株和变异 毒株在激活IRE1 通路的程度上有着显著的差异。 为验证内质网应激对 PRV 感染引起炎症反应的影响，本研究利用内质网应激抑制剂 4-PBA 处理病毒感染后的细胞。结果显示，药物处理后，变异毒株在病毒感染晚期引起的炎性因子上调 情况不再高于经典毒株，表明内质网应激能够正调控 PRV 感染所引起的炎症反应。随后，分别 通过siRNA 干扰试验和IRE1 激酶抑制剂KIRA6 处理试验下调或抑制IRE1 分子，结果显示IRE1 通路能够更大程度地抑制变异毒株引起的炎症反应，使变异毒株诱发的炎症反应不再强于经典毒 株，表明IRE1 激酶活性在PRV 调控炎症反应的过程中发挥重要的作用。 综上所述，本研究结果表明，相比于经典毒株，PRV 变异毒株能够通过高水平地激活内质网 应激IRE1 通路，诱发炎性因子IL-6、IL-8 及TNF-α 的高表达，从而诱发高水平的炎症反应。本 研究结果部分解释了PRV 变异毒株诱发高水平炎症反应的分子机制，为进一步探究PRV 变异毒 I 株引起更严重的病理损伤，更高致死率的机制提供理论基础，为 PRV 疫苗的开发及抗病毒通路 的筛选奠定基础。 关键词：内质网应激，炎性因子，PRV ，IRE1 通路 II