基于Mrp的猪链球菌病间接ELISA检测方法的建立.pdfVIP

摘 要 猪链球菌（Streptococcus suis ，SS）是一种在自然界中分布广泛的革兰氏阳性菌，猪、马、 牛、羊、鸡、小鼠等多种动物均可感染 SS 继而发病。其中猪的易感性最高，感染后的发病猪会 出现脑膜炎、关节炎、以及败血症等临床症状。同时，人也可以感染 SS 继而出现脑膜炎、败血 症等临床症状。由于 SS 引起的猪链球菌病的死亡率较高且该病的传播速度较快，给养猪行业造 成了巨大的经济损失，同时也严重危害着人类健康。因此，及时的检测与诊断是预防猪链球菌病 的关键。由于传统的病原分离培养和生化鉴定方法很难对该病做出及时且准确的诊断，并且也不 太适合大量样品的检测。所以，建立一种能够快速、准确并且高效的检测方法对该病的预防以及 流行病学研究具有重要的意义。 溶菌酶释放蛋白（Muramidase-released protein ，Mrp ）是SS 的一种重要的毒力标志因子，具 有良好的免疫原性。本研究对mrp 基因2617～3710 bp 区段进行扩增，并进一步原核表达和纯化。 对纯化的Mrp 蛋白进行Western blot 分析，结果表明该蛋白的反应原性良好。 用纯化的Mrp 蛋白作为包被抗原，建立了检测SS 血清抗体的间接ELISA 方法。实验分别对 抗原包被浓度、待检血清稀释倍数及作用时间、封闭液及封闭温度和时间、二抗稀释倍数及作用 时间、底物显色时间等进行了优化。并最终确定了该间接ELISA 方法的最佳实验条件为：抗原包 被浓度为0.05 μg/mL，待检血清1 ∶400 倍稀释37℃作用30 min ，5%脱脂乳作为封闭液37℃封闭 2 h ，二抗1 ∶15000 倍稀释37℃作用30 min ，底物显色时间为15 min ，临界值为0.226 。随后对 该方法的特异性、敏感性、重复性、临床样品的检测以及保存期等进行了评估。结果表明，该方 法的特异性为 97% ，并且与副猪嗜血杆菌（HPS ）、胸膜肺炎放线杆菌 （APP ）、猪蓝耳病病毒 （PRRSV）等几种常见的猪源细菌性以及病毒性疾病的阳性血清不发生交叉反应。同时，猪链球 菌2 型 （SS2）、7 型 （SS7）、9 型 （SS9）以及12 型 （SS12 ）阳性血清的检测结果均为阳性；敏 感性为96%，并且血清样品的最低检出上限为1 ∶3200 倍稀释；重复性试验中，批内以及批间的 最大变异系数分别为4.70%和7.20% ；对100 份临床血清样品用本实验建立的间接ELISA 方法和 玻片凝集试验同时进行检测，两者总符合率为85.3%；用该间接ELISA 方法对440 份临床猪血清 样品进行检测，其阳性检出率为27.7% ；已包被抗原的96 孔板在4 ℃条件下保存的6 个月内其特 异性以及灵敏性的变异系数均小于 10%。上述结果表明，本研究建立的间接ELISA 方法具有良 好的特异性、敏感性、重复性以及稳定性，并且适用于SS2、SS7、SS9 以及SS12 血清抗体的检 测，有望为猪链球菌病的诊断和流行病学调查提供一种可靠的技术手段。 关键词：猪链球菌，Mrp ，原核表达，间接ELISA I Abstract Streptococcus suis (SS) is a Gram-positive bacterium widely distributed in nature world, a variety of animals such as pig, horse, cattle, sheep, chicken, and mouse can be infected by SS. Among which pig has the highest susceptibility, the infected pigs will develop clinical symptoms such as meningitis, arthritis, and sepsis. Human is also susceptible to SS, clinical symptoms include meningitis and sepsis. Due to the high mortality of swine streptococcicosis caused by SS and the rapid spread