鸡APOBEC4的功能鉴定及其抗新城疫病毒的初步研究.pdfVIP

摘 要 载脂蛋白B mRNA 编辑酶家族 （apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like ， APOBEC ）成员具有保守的胞苷脱氨酶基序，能够诱导机体或病毒RNA/DNA 发生广泛的胞嘧啶 脱氨基突变，在机体先天性免疫与获得性免疫中均发挥重要作用。APOBEC4 是最新发现的该家 族成员，相关研究方兴未艾。为了确定鸡源APOBEC4 的功能及其在抗病毒免疫中的作用，我们 展开了以下研究： 通过DNA 重组技术构建APOBEC4 基因的原核表达载体，用IPTG 大量诱导APOBEC4 蛋白 在大肠杆菌中高效表达，继而获得纯化的鸡 APOBEC4 蛋白作为抗原，通过免疫小鼠获得抗鸡 APOBEC4 蛋白的小鼠多抗血清，为后续研究APOBEC4 蛋白在鸡体内的分布和表达含量的变化 以及进一步研究该蛋白的体外活性奠定了基础。 通过构建包含APOBEC4 基因的AID / APOBEC 家族进化树，发现鸡APOBEC4 与哺乳动物 和爬行动物APOBEC4 高度同源，但与鱼类APOBEC4 显示出一定的遗传距离。通过绝对定量方 法测定鸡源细胞系以及鸡体内的内源性 APOBEC4 表达，发现除外周血淋巴细胞外，APOBEC4 在其余细胞系的本底表达均不高；在体内，APOBEC4 在法氏囊中高表达。以人APOBEC3 的结 构为基础建立鸡APOBEC4 和人APOBEC4 催化域的3D 结构。结构相似性表明鸡APOBEC4、人 APOBEC4 和人APOBEC3G 含有相同的Zn 配位基序，具有相同的折叠倍数和可能相似的催化活 性。在漫长的进化过程中，APOBEC4 ZDD 结构域在序列和结构上均保持高度保守，这表明它对 生物体是不可缺少的。 在不同细胞中过表达APOBEC4 蛋白均能显著抑制NDV 病毒的复制，并且这种抗病毒作用 具有剂量依赖性。鸡APOBEC4 蛋白的抗病毒作用与其可能存在的RNA 编辑作用无关。经Co-IP 和IFA 鉴定可能是通过与NDV 的M 蛋白互作发挥作用。同时，鸡APOBEC4 蛋白的过表达能够 引起Caspase3 活化，这表明鸡APOBEC4 可能是通过引起凋亡发挥部分抗病毒作用。 病毒感染后，APOBEC4 在淋巴细胞和胸腺表达量大幅上升，这种组织分布与APOBEC 家族 另一成员AID 非常类似。对病毒感染后的细胞进行细胞因子检测，发现IFN-γ mRNA 水平显著升 高；用不同药物对细胞进行刺激，T 细胞活化刺激物能够使细胞中APOBEC4 表达量大幅上升。 表明鸡APOBEC4 在病毒感染后的高表达可能与细胞免疫相关。在MSB1 细胞中过表达APOBEC4 蛋白不能引起IFN-γ mRNA 表达水平改变，但用IFN-γ 处理细胞，可见APOBEC4 mRNA 表达水 平显著上升，表明APOBEC4 可能是IFN-γ 下游的效应因子。 综上，APOBEC4 是一种宿主限制因子，不仅起到非RNA 编辑依赖的抗病毒作用，而且还通 过调节获得性免疫的方式抑制病毒复制。这些结果表明，APOBEC4 在鸡的先天性免疫和获得性 免疫应答中均发挥重要作用。 关键词：鸡APOBEC4 ，脱氨酶，RNA 编辑，抗病毒，新城疫病毒 I Abstract The apolipoprotein B mRNA editing enzyme family play an important role in both innate and adaptive immunity. Due to the conserved cytidine deaminase motif, APOBEC proteins can induce a wide range of cytosine deamination mutations and participate in immune responese. APOBEC4 is a newly discovered member of thi