施氏假单胞菌铁吸收调节蛋白Fur介导的固氮调控机制.pdfVIP

摘 要 铁在微生物的各关键代谢中起重要辅因子的作用。铁吸收调节因子Fur 是革兰氏阴性菌中铁 代谢的核心调控元件，在含铁蛋白的活性调控及微生物–宿主互作过程中发挥重要作用。施氏假 单胞菌A1501 是一株根际联合固氮菌，其高效固氮及根表定殖需要大量含铁蛋白（如固氮酶）的 参与。前期研究发现fur 基因突变导致A1501 菌的固氮酶活显著下降，暗示Fur 可能参与固氮基 因表达调控，但具体机制尚不清楚。此外，非编码RNA PrrF 被报道通过RNA–RNA 互作在转录 后水平调控含铁蛋白SodB 的表达，A1501 菌中该ncRNA 是否参与固氮酶的表达调控值得深入研 究。本研究通过测定不同外界铁条件下菌株的生长、固氮等表型明确了Fur 对胞外铁的响应规律， 并结合转录组分析、蛋白–DNA 互作及RNA–RNA 互作等方法探究了A1501 菌中Fur 蛋白调控固 氮基因表达的分子机制。主要研究结果如下： 1. 测定了野生型A1501 、fur 突变株∆f ur 和回补株com-fur 在铁丰富（基本K 培养基，50 μM Fe3+或Fe2+ ）和铁限制 （K 培养基含0.5 μM Fe3+或Fe2+ ）条件下的生长及固氮表型，结果发现菌 株间无显著生长差异，表明0.5 μM 的铁浓度（Fe3+或Fe2+ ）均能够满足生长所需；固氮酶活测定 发现，A1501 和∆fur 在铁元素为Fe2+ 的培养基中的固氮酶活比Fe3 + 时高30%，表明Fe2+可能更适 于菌体生物固氮；铁丰富条件下A1501 和∆fu r 的固氮酶活均为铁限制条件下的2 倍左右，Western Blot 检测结果表明，Fur 蛋白在铁限制条件下表达上调，qRT-PCR 结果也表明fur 基因的表达可 响应低铁信号。 2. 分析了野生型A1501 和∆fur 分别在铁丰富（基本K 培养基，50 μM Fe3+ ）和铁饥饿（添 加过量铁螯合剂）条件下生长至对数期的转录组，结果表明，铁丰富条件下∆fur 中有146 个基因 较野生型表达差异显著（88 个上调，58 个下调），其中TonB 依赖型摄铁系统TonB-ExbBD 、细 胞色素c 成熟系统Ccm 和反硝化核心酶Nir/Dnr/Nor 编码基因表达显著上调；铁饥饿条件下，∆fur 中有150 个基因相比野生型表达差异显著（49 个上调，101 个下调），如rpoH 表达显著下调。启 动子分析表明，上述编码基因（簇）PST0819-exbB2-exbD2-PST0822 、dnrS 、nirH 、ccmA 、nfiS 和rpoH 等启动子区存在Fur 蛋白保守识别位点，暗示Fur 可能对这些基因的表达存在直接调控。 3. 探索了Fur 参与固氮活性调控的分子机制，存在转录和转录后两种作用方式：在转录水平， Fur 蛋白与固氮酶铁蛋白基因nifH 的启动子互作，正调控nifH 基因的表达，EMSA 实验证实Fur 蛋白与nifH 启动子区存在体外互作；在转录后水平，Fur 蛋白负调控ncRNA PrrF 的表达，PrrF 通过与nifH mRNA 及钼铁辅因子合成基因nifQ mRNA 直接互作，影响固氮酶的合成及组装。prrF 的启动子区存在Fur 蛋白保守识别位点，EMSA 实验证实Fur 蛋白与prrF 启动子区存在体外互作， Northern Bolt 结果表明，PrrF 的表达受fur 和铁的负调控；RNA 二级结构预测发现PrrF 与nifH 和nifQ mRNA 存在可能结合位点，MST 实验证实了PrrF 与两mRNAs 片段均存在体外互作。 综上所述，Fur 蛋白通过调节自身表达参与菌体的铁响应，可能直接参与铁转运、氮循环和 热激抗性相关基因的转录调控；本研究首次报道了铁转运蛋白在转录和转录后水平直接参与固氮 调节的分子机制，为深入解析固氮菌的调控网络及环境适应机制奠定了理论基础。 关键词：施氏假单胞菌A1501 ，信号响应，固氮调控网络，铁吸收调节因子Fur ，非编码RNA PrrF I Abstract Iron, an essential element for micr