《免疫学检验技术》 6.ELISA检测HBVM（三） ELISA检测HBVM（三）.pptxVIP

乙型肝炎病毒核心抗体诊断 （酶联免疫法） 实验目的 1.掌握竞争法测抗体的原理和方法。 2.学会正确判读竞争法的实验结果。 3.树立生物安全意识和质控意识。 实验原理 采用基因工程重组HBcAg包被反应板，加入待测样本，同时加入抗-HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测样本抗-HBc含量高，抗-HBc-HRP与HBcAg结合少，加入TMB底物显色时淡，反之则深。 实验器材 酶标仪 洗板机 恒温孵育箱 ELISA试剂盒 实验方法 1、选取反应板条加载于酶标板上并编号。加5μl待测样本和阴、阳性对照于反应孔中（做一个空白对照、一个阳性对照、一个阴性对照，剩余5孔加血清样本） 2、各反应孔中加入一滴（50μl）酶结合物（空白孔除外） 3、手工轻轻震荡10秒钟，将反应板37℃孵育30分钟。 4、洗涤5次： 手工洗板：弃去孔内溶液用配制的工作浓度洗涤液注满每孔，静置30秒钟，甩干，重复5次。然后拍干。 酶标仪洗板：（略） 5、洗涤结束后立即向所有孔中加入显示剂A、显色剂B各50ul（一滴）,手工轻轻震荡10秒钟，将反应板37℃孵育15分钟 6、目视比色法：观察对照孔与样本孔显色情况。 7、酶标仪测定法： 在所有孔中加入50ul终止液，震荡反应5秒，使其充分混匀 用酶标仪读数，波长450nm，参考波长630nm,读取各样本孔OD值（由老师指定两组仪器测定并报结果，并熟练酶标仪项目设置，其他同学可待指定组完成实验后使用仪器） 参考值 待测样本如用生理盐水做1:30稀释，检测介个临床意义；或原血清不作稀释，检测结果为流行病意义。 未稀释Cut-Off Value=阴性对照平均OD值×0.3 1:30稀释Cut-Off Value=阴性对照平均OD值×0.5 参考值 空白对照：双波长读数（检测波长450nm，参考波长630nm),空白对照吸光度应该≤0.015 阴性OD对照值：OD≥1.000 阳性OD对照值： OD ≤ 0.050 检测方法的局限性 此方法仅使用于个体的血清或血浆检测，不适用于混合血清或血浆样本以及其他体液样本 检测高度溶血的样本，血液没有完全凝固的血清样本、有微生物污染的样本，和使用叠氮钠防腐的样本会有错误结果， 注意事项： 1. 试剂盒应 2℃～8℃避光保存，使用前在室温中平衡 30 分钟，剩余包被条需密封防潮。 2. 试剂使用前先摇匀，后垂直滴加。显色完毕，在 10 分钟内完成比色和判断结果。 3. 用洗板机洗板时，每孔加洗涤液需≥300μl，并注意检查堵孔现象。洗板和拍板时防止外源性过氧化物酶 类似物或氧化还原物质与显色剂发生反应，干扰实验结果。 4.  使用本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程操作。 5.  不同批号试剂不得混用。试剂盒有效期 6 个月。