基因枪转化流程.docx

基因枪法转化流程 一． 实验材料 豫麦 18 二． 实验步骤 愈伤组织的诱导 取大田小麦开花后 15 天的麦穗，剥出幼嫩种子，用 70%的乙醇消毒 1min ，用灭菌水冲 洗三次，再用 0.1%的升汞消毒 15min ，用灭菌水冲洗 4 次，然后在超净工作台上用解剖 镊剥取幼胚，幼胚大小在 1.0~1.5mm比较好，盾片朝上接种在诱导培养基上， 25C，暗 培养 2 周。 受体材料的预处理 诱导培养 14 天后将产生淡黄色的新鲜愈伤组织，选取生长状态良好的的颗粒状胚性愈 伤组织为转化受体材料，轰击前进行渗透处理，在高渗培养基上培养 6 小时。 基因枪轰击 用 Bio-Rad 公司生产的 PDS-1000/He 型基因枪对愈伤组织进行轰击，轰击材料集中置于 培养皿(9cm)中心不大于3cm的范围内，受轰击后的愈伤在继续在渗透培养基上 25 C 暗培养 18h 后散开。 过渡培养 将上面的愈伤转入愈伤组织诱导培养基上进行过渡培养 2周，25C黑暗或弱光培养。该 培养基中潮霉素等选择压力，以利于受轰击细胞的恢复及充分表达外源基因。 转化体的筛选和再生 愈伤组织过渡培养 2 周后，转移到附加有 110mg/L 潮霉素的筛选培养基中进行筛选培养 14 天，筛选后的愈伤再转移到附加潮霉素的分化筛选培养基上进行筛选培养 14 天，光 强为3000IX，每天光照16h, 23C。待分化长出的芽长至 2?3cm高时，再转移到附加有 潮霉素的生根培养基中进行生根培养 2?3周，然后壮苗培养并移栽。 附：一 各培养基配方 MS培养基配方: 成分 分子量 使用浓度（mg/L） r ,曰―\ 人里儿糸 硝酸钾 101.11 1900 硝酸铵 80.04 1650 磷酸二氢钾 136.09 170 硫酸镁 246.47 370 氯化钙 147.02 440 微里儿糸 碘化钾 166.01 0.83 硼酸 61.83 6.2 硫酸锰 223.01 22.3 硫酸锌 287.54 8.6 钼酸钠 241.95 0.25 硫酸铜 249.68 0.025 氯化钻 237.93 0.025 铁盐 乙二胺四乙酸二 钠 372.25 37.3 硫酸亚铁 278.03 27.8 有机成分 肌醇 100 甘氨酸 2 盐酸硫胺素 VB1 0.1 盐酸吡哆醇 VB6 0.5 烟酸VB5或VPP 0.5 蔗糖 342.31 30g /L 琼脂 7 g /L (2)诱导培养基配方： MS 基本成分 + 2,4-D2mg/L + ABA0.5mg/L + 蔗糖 30g/L + Gelrite 4g/L, PH5.8) (3)高渗培养基配方： MS基本成分 + 2,4-D 2mg/L + 蔗糖30g/L +甘露醇0.5mol/L + Gelrite 4g/L , PH5.8; ⑷筛选培养基配方：MS基本成分 + 2,4-D 2mg/L +蔗糖30g/L + Hm (选择浓度) + Gelrite 4g/L ， pH 5.8； (5)分化培养基配方： MS 基本成分 + IAA 1.0mg/L + ZT 2mg/L + Hm (选择浓度) + 蔗 糖 30g/L + 琼脂 10g/L ， pH 5.8 (6)生根培养基配方： 1/2 MS 基本成分 + IAA 0.2 mg/L + 30 g/L 蔗糖 + 琼脂 10g/L ， pH 5.8 二 用基因枪轰击的方法 金粉-DNA复合体的制备 称取50mg金粉放入1.5ml灭菌离心管中。 加入1ml无水乙醇，震荡1?2min，使金粉充分散开，以 12000r/min离心1min，弃上 清。再加 1ml 无水乙醇，重复此步操作三次后，将金粉悬浮于 1ml 灭菌水中，再按上 述步骤清洗金粉三次，最后将金粉悬于 1ml 无菌蒸馏水中，现用或 -20 度保存。 吸取 50ul 金粉悬浮液， 加入 5ug 质粒 DNA ，振荡混匀， 再依次加入 50ul2.5mol/LCaCl2 和20ul0.1mol/L 亚精胺(现用现配)，加每种试剂时都要混匀， 振荡3min,以12000r/min 离心20s,弃上清。 以 250 ul 无水乙醇漂洗两次后,加入 120ul 无水乙醇悬浮。 装弹 (1 )将基因枪放置在一个较大型的超净工作台上,以利于无菌操作。用 70%的乙醇擦净真 空室，用浸泡消毒法将可裂圆片、微粒子弹载体、 阻挡网于70%乙醇中消毒15min,然 后用无菌滤纸吸干或吹干残余乙醇。 ( 2)打开电源开关、真空泵及氦气瓶阀。 将可裂圆片装入固定盖,旋紧。 取6ul包被DNA的金属颗粒无水乙醇悬浮液(约含 0.25ug质粒DNA和125ug的金粉) 均匀的涂布于微粒子弹载体中心,立即在干燥器中干燥,或于工作台上吹干。 将载有微粒子弹的载体及