基因克隆的质粒载体.docx

基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒， 其中已经作了比较 详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 F质粒又叫F因子或性质粒(sex plasmid )。它们能够使寄主染色体上 的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且 通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的 抗菌素抗性能力。 Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成 的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有 Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死 的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性 、质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。 绝 大多数的质粒都是由环形双 DNA组成的复制子(图4-1)。 大肠杼蕭质轉分子的跡构示愆图 质腔垦细宿聲色怖并简擁自風豐制的咔理取fit的井产?集码抗阳素抗性基囚的 质垃叫尺质粒*兀部分质暫垦町以转擁的.但也存在着不陡墙转暮的成粒 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又 可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到 后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： ?当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形 DNA( cccDNA，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； ?如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现 有一至数个缺口时，称之为开环 DNA( ocDNA，此即0C构型； ?若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线 性分子(IDNA，通称L构型(见图4-2)。 质粒DNA的分子构型g 性的环的0C 质粒DNA的分子构型 g 性的环的0C枸学： (c)翅螺建的SC构型 质粒DM岛嫌脂巒聲校吐僚複式用 由于琼胭慚屮加冲戏人既轻花汽比乙锭“囚叱. 齐紫外牡哩曲下 m 电*益带望格前■邑， 道中的SC DMA 4! fKVffE的Jft荫汨■ IK IJ^A {4■]■?!?的毗笳lib 讣)ifi 屮 址鏡踐和内灼队舸能厉別贞竝 止笳产生的在器莊中的也世卜十 (K DNA fll SI DNA Z 问 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒 DNA尽管分子量相同，仍具 有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是 SC DNA其后依次是L DNA和0C DNA(图 4-3)。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒 DNA分子，都必定包括如下 三种共同的组成部分，即复制基因(replicator )、选择性记和克隆位点。 二、 质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%^3流右，但却编码着一些重要的非染色 体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。 三、 质粒DNA的转移 质粒的类型 革兰阴性细菌的质粒可以分成接合型和非接合型的两种类 群。 接合型的质粒(conjugative plasmid )，又叫自我转移的质粒。它们除了 具有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移 的基因。 非接合型的质粒(non-conjugative plasmid )，亦叫不能自我转移的质粒。 它们虽然具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配骊和接合转移的基因， 因此是不能够从一个细胞自我转移到另一个细胞。 F质粒 又叫F因子，即致育因子(fertility factor )的简称，是在 某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表性的单拷贝的接合型质粒。 F质粒有 三种不同的存在方式： (i ) F+细胞：以染色体外环形双链质粒 DNA形式存在，其上不带有任何来 自寄主染色体的基因或DNA区段。 (ii ) F细胞：以染色体外环形双链质粒 DNA形式存在，同时在其上还携 带着细菌的染色体基因或 DN区段。 (iii ) Hfr细胞(高频重组细胞)：以线性DNA形式从不同位点整合到寄 主染色体。 F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的 F-细胞则 叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须(pilus )的结构，它促进 雄性细胞同雌性细胞进行配对。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培 养，由于性须的作用，就会形成雌-雄细胞配对。我们称这种过种为细菌的接合 作用(conjugation )。配对之后F-受体细胞获得了 F因子，也变成为F+细胞 由F因子整合到染色体而成的Hfr细胞，就可能相发寄主染色体发生高频转 移。这是一种可逆的过程，在一定的条件下， Hfr细胞又可重新变参展F+或F 细胞。质粒的主要类型见 表4-1。 几种主要的质粒类型 按接合转密