免疫学检验 免疫系统 细胞因子.pptVIP

（四）趋化活性测定法 趋化试验 原理示意 （四）趋化活性测定法 生物学活性测定方法学评价 敏感性较高 特异性不高 操作烦琐 易受干扰 二、细胞因子的免疫学检测法 利用抗原抗体反应的原理，制备出抗细胞因子的单克隆抗体或多克隆抗体，通过同位素、荧光素或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量分析细胞因子。 二、细胞因子的免疫学检测法 （一）酶联免疫吸附试验（ELISA） 是定量分析中最常用方法。但不能判断细胞因子的生物学活性。 二、细胞因子的免疫学检测法 ELISA方法 ELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISA的基本步骤，可作定性或定量分析。ELISA法不仅可以用于细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定 二、细胞因子的免疫学检测法 ELISA方法 优点 特异、简便 易于推广和标准化等优点 可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理 细胞因子测定的首选方法 缺点 敏感性偏低 不能判断细胞因子的生物学活性。 (二)酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot) 基本原理 在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。 一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关 (二)酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot) ELISPOT 二、细胞因子的免疫学检测法 （三）流式细胞分析法 流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。 （三）流式细胞分析法 基本步骤: 1 2 3 4 分离和培养待检细胞 细胞固定 封闭非特异性结合位点 染色与分析 （三）流式细胞分析法 激活 膜抗原标记 细胞内细胞因子标记 细胞内细胞因子检测技术 （三）流式细胞分析法 使用流式细胞分析法，可以： 区分不同分泌特性的细胞亚群： Th1细胞 IFN-γ Th2细胞 IL-4 细胞表面的粘附分子或细胞因子受体： 单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态 （三）流式细胞分析法 免疫学测定方法学评价 优点： 特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标 准化。 （三）流式细胞分析法 免疫学测定方法学评价 缺点： 所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合 三、细胞因子的分子生物学检测法 利用分子生物学技术，制备出细胞因子的基因探针，通过分子杂交技术检测细胞内细胞因子基因的表达，这是一种高度敏感和高度特异的检测技术，目前在实验室研究中使用较广，其缺点是操作较为烦琐，测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。 三、细胞因子的分子生物学检测法 （一）Northern印迹杂交法 Northern印迹杂交是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。从细胞中提取RNA，经甲醛、琼脂糖凝胶变性电泳，分离单链RNA，并将RNA转印到硝酸纤维素膜上，再与特异序列DNA探针进行杂交。 三、细胞因子的分子生物学检测法 （二）斑点杂交法（dot bloting） 本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。该法先将RNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上，可用手工操作点样，也可用斑点式点样器点样，再与特异性探针进行杂交。 三、细胞因子的分子生物学检测法 （三）PCR与逆转录PCR PCR即聚合酶链式反应。聚合酶链式反应这种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。 RT-PCR即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的PCR相结合的技术。 三、细胞因子的分子生物学检测法 （四）原位杂交和原位PCR RNA-DNA原位杂交是在细胞内mRNA原有位置上进行杂交，细胞则尽可能保持原有形态。 原位PCR是在组织细胞里进行