蛋白质的分离纯化方法.docxVIP

根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质 , 并且不同蛋白质的分子大小不同 , 因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开 , 并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、 超滤、离心和凝胶过滤等。 透析和超滤是分离蛋白 质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中 , 再浸入 透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜 , 而蛋白质被截留在半透膜上的过程。 这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用 , 在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中 , 滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞 , 以致超滤速度减慢 , 截流物质的分子量也越来越小。 所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜 , 也可以选择切向流过滤得到更理想的效果 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。 当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如 , 在从大米渣中提取蛋白质的实验中 , 加入纤维素酶和 α - 淀粉酶进行预处理后 , 再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离 [3] 。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度 ( 区带 ) 离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、 聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。 可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白 , 得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等 [6] 通过比较不同密度梯度介质的分离效果 , 利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。 凝胶过滤也称凝胶渗透层析 , 是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。 凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时 , 比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构 , 而被排阻在凝胶珠之外 , 随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外 ; 反之 , 比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。 在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果 , 纯度鉴定证明产品为分子量约为 32 kDa、成分是多糖∶蛋白质 (88 ∶12) 、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白 [1] 。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质 [7] 。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多 , 比如溶液的 pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下 , 不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度 , 根据蛋白质分子结构的特点 , 适当地改变外部条件 , 就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度 , 达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点 沉淀和 pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和 pH 值调节是最常用的方法。 每种蛋白质都有自己的等电点 , 而且在等电点时溶解度最 低 ; 相反 , 有些蛋白质在一定 pH 值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的 pH 值来分离纯化蛋白质。王洪新等 [8] 研究茶叶蛋白质提取过程发现 ,pH 值为时茶叶蛋白提取效果最好 , 提取率达到 36·8%,初步纯化得率为 91·0%。李殿宝 [9] 在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的 pH值调到 3~4, 使目标蛋白于等电点沉淀出来。等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取。 李凤英等 [10] 测得葡萄籽蛋白质的等电点为 3·8。他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质 , 得到了最佳的提取工艺为 : 以 1×10- 5mol·L-1 的 NaOH溶液 , 按 1∶5 的料液比 , 在 40℃搅拌 40 min, 葡萄籽蛋白质提取率达 73·78%。另外还可以利用碱法提取大米蛋白 , 其 持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取 [11] 。利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白 , 蛋白质产率高达 90%[12]。 蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象 ,其中,增 加蛋白质溶解度的现象称盐溶 , 反之为盐析。应当指出 , 同样浓度的二价离子中性盐 , 如 MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果 , 要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质 , 其最佳提取工艺是 : 以 10%NaCl溶液 , 按 1∶25 的料液比 , 在 30℃搅拌提取 30min, 蛋白质提取率为 57·25%[10]。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用