微生物育种技术 单元五 工业菌种育种技术、项目一 自然选育技术、微生物育种技术、任务一 乳酸菌的分离纯化及酸乳制作 单元五——项目一细菌育种技术.ppt

* * F因子传递“滚环模型” ：①F因子的一条DNA单链在特定位置上发生断裂；② 断裂的单链逐渐解开，同时以留下的另一条环状单链作模板，通过模板的旋转，将解开的单链通过性菌毛推入F-中，同时在供体细胞内，重新合成一条新的环状单链，取代解开的单链；③ F-细胞中，外来DNA单链上也合成一条互补的新DNA链，恢复成环状双链F因子，F-变成了F+。 * （二）重组子的筛选 F-品系（受体）： 不能合成 met、leu、trp、his、ade or pro、arg 不能利用 lac、gal 选择性标记基因目的：选择出全部的重组子，排除杂交中的受体菌。 措施：培养基中不加Met和Leu。 Met和离Leu离原点最近 反选择性标记基因目的：排除供体菌，同时保证全部的重组子存活。 措施：在培养基中添加链霉素(Str)。 Str离原点最远，使Hfr染色体更多机会进入受体 供体CSH60 1环菌 接种 37°C 10~12h 受体CSH57 LB LB 1环菌 1ml 1ml 37 °C 2~3h 扩菌 LB LB 0.2 ml 4 ml 接合 37 °C 振荡100‘ A对照 A对照 A A A A A A 0.1ml 0.1ml 涂A板 点５０个单菌落 点５０个单菌落 37 °C 24~48h 点A板 37 °C 24~48h B C D E F G 点B-G板 37 °C 24~ 48h 观察结果 3个200μL 3个100μL 对应不同选择平皿上长出的菌落位置，就可以确定该菌株接合的结果 项目五 细菌原生质体融合育种技术 细菌原生质体融合是20世纪70年代发展起来的重要基因重组技术。1976年FODORK等采用聚乙二醇（PEG）、磷酸钙诱导巨大芽孢杆菌原生质体的融合，SCHAEFFEP等报道了用PEG诱导枯草芽孢杆菌的原生质体融合，这2项重要研究成果同时发表在美国科学院院报上，是细菌原生质体融合技术发展的里程碑，经过30余年的发展，已经成为细菌遗传育种的一项基本技术。 原生质体融合 原生质体：细胞壁被酶解或突变脱落后，剩下原生质膜包裹着的球状体。就是没有细胞壁的细胞。 特点：所有原生质体呈球状，对外界环境因素敏感，使细胞间生物信号无法识别。 －*－ 原生质体融合：利用物理或化学方法，诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。 细菌原生质体融合育种优势 (1) 克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。 (2) 基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组 (包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。 细菌原生质体融合育种优势 (3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。 (4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。 原生质体融合的过程 亲株 甲 乙 原生质体 融合体 酶解 融合 再生 再生 筛选 原生质体融合技术的方法 原生质体融合育种一般包括如下步骤： ①标记菌株的筛选； ②原生质体的制备； ③测定原生质体再生率； ④原生质体的融合； ⑤原生质体再生； ⑥融合子的选择； ⑦实用性菌株的筛选。 －*－ 1.标记菌株的筛选 亲本菌株的选择性遗传标记是筛选融合子的前提，是细菌原生质体融合技术得以应用的关键。 细菌原生质体融合过程中，营养缺陷型标记、抗药性标记、荧光染色标记、灭活标记等被经常采用。 2.原生质体的制备 机械法：现在基本上不采用 酶解法：常用 不论哪种方法，必须是在高渗环境中操作 原生质体的制备 微生物种类不同其细胞壁结构和化学组成不同，酶解处理的有效酶也不一样，因此要根据微生物种类特性选择合适的酶。 －*－ 细菌细胞壁的结构G+ 肽聚糖、多糖、蛋白质、磷壁酸、糖醛酸、脂多糖 G- 肽聚糖、磷壁酸、蛋白质、类脂、脂多糖、脂蛋白 放线菌的细胞壁 二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖 真菌的细胞壁成分 纤维素、几丁质、其它多糖 降解细胞壁所用酶类： 处理细菌细胞壁用酶：溶菌酶 处理放线菌细胞壁用酶：裂解酶、溶菌酶 处理真菌用酶：纤维素酶、酵母裂解酶、β-1,3葡聚糖酶、几丁质酶、蜗牛酶 －*－ 影响原生质体制备的主要因素 酶用量：溶菌酶 0.1-0.2mg/ml