BAC文库构建与筛选实验程序-2007-3-10.docVIP

BAC文库的构建及筛选实验程序 BAC文库的构建与组装/高密度膜的制备/BAC文库的筛选 ………………………………………………………………………………………………… BAC文库的构建 高分子量核DNA的制备 细胞核的分离 取液氮冷冻的保存于超低温冰箱中生长三周的植株幼苗（50克）在充足的液氮中研磨成精细的粉末。 将研磨好的粉末放入1个盛有500ml冰上预冷的含有0.15%β-巯基乙醇和0.5%Triton X-100的1×HB（Wash buffer）缓冲液中, 冰上轻柔搅匀约15分钟，用2层纱布和2层Miracloth或4层纱布过滤到已经预冷到4℃的250ml离心瓶中。 4℃，3200rpm，离心20分钟。 小心弃去上清，加入1ml冰上预冷的1×HB（不含Triton X-100，含0.15% β-巯基乙醇），在小毛刷帮助下悬浮沉淀，并将每个离心瓶中悬浮起来的细胞核转移到50毫升离心管中，加满1×HB（不含Triton X-100，含0.15% β-巯基乙醇）。 4℃，4000rpm，离心15分钟沉淀细胞核。 用1×HB缓冲液（不含Triton X-100，含0.15% β-巯基乙醇）反复清洗细胞核1-3次，去除细胞核内细胞器杂质污染。每次均为4℃，4000rpm，离心15分钟，倒出上清。 用1×HB缓冲液（不含Triton X-100和0.15% β-巯基乙醇）清洗细