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质粒载体的构建－菜鸟入门手册 dongkey 制作 本人刚刚完成质粒载体的构建，总结了一下，以方便要做这方面的菜鸟同学借鉴一下，希望 老鸟同学批评指教。 一、确定插入的基因片段。 首先要确定自己要插入载体中的基因片段，比如要做蛋白表达和功能，可以选择CDS 区进 行插入。然后自然是如何得到这段基因片段的问题了。最常见的是PCR 解决了。那么就涉 及到引物的设计。插入 CDS 基因片段的例子：找到 CDS，根据CDS 设计全长引物，然后 加上内切酶的碱基片段（这要根据自己手头上有的质粒的内切酶位点来决定了），注意，前 面要加上保护碱基！然后进行PCR 。 PCR 后要跑电泳确定目的基因的长度是正确的。 用乙醇沉淀法纯化PCR 产物（具体见分子克隆一书） 菜鸟体贴提示：要在质粒上找到两个最好不是连续在一起的内切酶，然后分别添加在两条引 物的 5 ‘端，当然内切酶的温度最好是一致的，而且可以能够同时切开的（双酶切）。这可 以在试剂公司的限制性内切酶的列表上找到有没有共同的BUFFER 及其双酶切时的活性如 何（当然是越大越好了）。内切酶的公司一般可以找NEB, TAKARA, TOYOBO 等公司，本 人用的是TAKARA 。 二、酶切 将质粒和基因片段分别进行酶切。最省事的是同时双酶切了。一般酶切温度都是37 度。 菜鸟体贴提示： 1、确定质粒和基因片段的量！！（宁少不多），根据说明书加样，一般是DNA ＋BUFFER ＋ 加内切酶。注意BUFFER 的比例，有的是1×，有的是1.5×。 2 、确定内切的时间。这是比较讨厌的环节。切的时间不能短，也不能太长。最好是做一个 梯度。注意，说明书的内切时间不一定就是标准的！！（本人经验是可以稍微切的时间长 一点，也不用短了） 3、确定酶切成功了。 对于质粒，可以将空质粒和切开的质粒同时电泳跑，对比一下就知道了 对于目的基因，很难，因为切开的是几个碱基而已，不过一般如果质粒切开，目的基因 应该也会被切开的。 酶切完成后，有两种方法回收 1、电泳跑胶回收 2 、不跑胶，直接用纯化试剂盒回收。 根据N 多种理论，很多人建议用第一种方法较好。理由这里就不罗列了。 三、感受态大肠杆菌的制备。 这里建议按照分子克隆的CaCl 方法进行制备（书上已经详细列出了步骤，菜鸟也能做的）。 感受态的好坏关系到转化效率，因此要认真对待。不过貌似也不是很难。 保存要在－80 度保存，也有某位仁兄告诉我4 度放一放效果更好，没有试过，书上都是－ 80 度的。当然，放的太久转化效率会随时间而减弱。 如果有钱的同学就不需要费那么多功夫了，直接买就是了。本人是买TAKARA 的，300 大 洋，10 支。 四、连接 很多公司都有快速连接试剂盒和普通试剂盒。一般都是16 度数个小时或者过夜，或者4 度 过夜，不一而同。曾在园子里看到一个高人的文章，认为是时间越长越好，甚至建议4 度放 几天，我没有试过。16 度可以用PCR 仪创造，或者找一个泡沫盒，加上冰，水搞到 15 度 左右，放入4 度冰箱即可。我用的TAKARA 的快速连接试剂盒，4 度过夜。 菜鸟体贴提示： 1、通过电泳，粗略判定质粒和DNA 的浓度比例。一般加入连接液的DNA:质粒＝9 ：1 2 、放入质粒和DNA 的总量要适当，不可超过说明书，宁少不要多。 五、转化 按照分子克隆的步骤来。 如果是买公司的感受态，根据公司的说明书。 菜鸟提示： 1、复苏的时间一定要掌握好，还有是装感受态的管子要薄，以有利于温度的传导。一般用 恒温水浴。 2 、涂抹在培养皿上的时候，可以做一个梯度，200ul ，300ul，400ul ，一定要晾干。 六、确定测序的克隆。 一般在培养皿上挑 10－30 个左右的单克隆。加入培养液（含抗生素）过夜培养，后用 2ul 的培养液，加上步骤一的引物，进行PCR ，电泳，看有没有目的基因的条带。 然后将有条带的培养液提取质粒，双酶切，电泳看看有没有目的基因的条带。如果有的话， 可以送去测序了。 菜鸟提示： 1、可以绕过PCR 直接提取质粒酶切（如果挑的克隆太多的话，建议还是先PCR 以缩小范 围）。 2 、如果目的基因较小的话（如 100－300bp ） ，那么酶切后电泳加样要尽量多一点，因为切 下来的目的基因的亮度对比质粒的亮度是100－330/数千bp 分之一。