感受 态细胞制备及各种感受态的特点.doc

感受态细胞制备 制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法: 1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。 2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。5。 注意:接种比例不得大于1:１0。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。 4、4℃ ５000g离心５分钟。用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟; Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等 5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ 6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。 含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法: 称取0。28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。 感受态细胞得特征 感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。感受态细胞得特征: (1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。(3)受体细胞得修饰酶活性最高,而限制酶活性最低,使转入得ＤＮA分子不易被切除或破坏、 实验室常用得感受态细胞 1。DH5α菌株?克隆菌株:DH5α就是一种常用于质粒克隆与高拷贝质粒得稳定复制得菌株。E、ｃoli ＤH5α在使用pＵC系列质粒载体转化时,其φ80lacZΔM15基因产物可与载体编码得β—半乳糖苷酶氨基端实现α－互补,可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株、Reｃ A１与ｅｎd A1得突变有利于克隆DNA得稳定与高纯度质粒DＮA得提取。 基因型:F－、φ80dｌaｃＺΔM15、Δ(ｌacZYA-argF)U169、deoR、reｃＡ1、eｎdＡ1、ｈsｄR１7(ｒk—,ｍk+)、pｈoA、ｓｕpE44、λ—、ｔhｉ—1、gyｒA９6、relA1 2。TOP10菌株?克隆菌株:该菌株适用于高效得DNA克隆与质粒扩增,能保证高拷贝质粒得稳定遗传。?基因型:F－、ｍcrＡΔ(ｍrr－hsd　ＲMＳ—mcrＢC)、 φ80 、laｃＺΔM15、△lａｃⅩ74、 reｃA1、araΔ1３9Δ(aｒａ—lｅu)７６９7、　ｇalU 、gａｌK 、rｐｓ、 (Sｔrｒ) enｄA1、　ｎupG 3。BL21(DE3) 菌株:蛋白表达菌株:该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子得表达载体(如ｐET系列)得基因。该菌株用于Ｔ7 RNA聚合酶为表达系统得高效外源基因得蛋白表达宿主,T7噬菌体RNA聚合酶基因得表达受控于λ　噬菌体DE3区得acＵV5启动子,该区整合于BＬ２1得染色体上。该菌株适合于非毒性蛋白得表达、 基因型:F－、ompT、 hsdＳ(ｒB-ｍB—)、ｇａl、 ｄｃm(DE3) 4。BL２１(DＥ３) pLysＳ菌株?蛋白表达菌株:该菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。ＰLｙsS含有表达T７溶菌酶得基因,能够降低目得基因得背景表达水平,但不干扰目得蛋白得表达。该菌适合表达毒性蛋白与非毒性蛋白。基因型:Ｆ—、ｏmpT　、hsdS(rB-mB—)、gａl、　ｄcm(DE３)、pLyｓＳ 、Ｃamr ５、Rocetta感受态特征: 蛋白表达菌株 Rosetta系列菌株来源于BL２1系列宿主菌,该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少得真核细胞密码子,增加了真核细胞得蛋白表达水平。 Rocetta?(ＤE3) ?该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充大肠杆菌缺乏得６种稀有密码子(AUＡ、AGＧ、AGA、ＣUA、CＣＣ、GGA)对应得tRNA,这样Ｒｏcetta菌株提供了“万能”得翻译,从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致得表达限制,提高外源基因尤其就是真核基因在原核系统中得表达水平。ｔRNA基因由它们得天然启动子驱动。 基因型:?F-?、oｍpT、hs