microrna-28-5p调控高密度脂蛋白相关代谢通路的机制性研究和临床研究.pdfVIP

microRNA-28-5p 调控高密度脂蛋白相关代谢通路的机制性研究 和临床研究 micro RNAs(mi RNAs)是一类非编码小分子RNA,通过与信使RNA(messager RNA,m RNA)3’端非编码区(3’untranslated region,3’UTR)序列结合,抑制靶 RNA 翻译或促进 RNA 降解。mi RNAs 作为精细调控因子,在机体复杂的病理生 理过程中发挥着重要作用。 研究证实,mi RNAs(mi R-1、mi R-133 和mi R-499)被证实参与调控心脏发 育和心血管系统的正常生理调控过程。mi RNAs 在时间和空间上表达谱的改变均 可提示不同的病理过程(如急性心肌梗死、心衰)。 近年来,血浆mi RNAs 分子因其稳定性和易检测性在心血管研究领域中已越 来越受到人们的广泛关注,为揭示其分子生物学功能提供新的线索,并有望成为 疾病诊断和分子治疗的靶标。mi R-28 作为内含子型mi RNA,定位于3 号染色体 LIM 区域LPP(Lipoma Preferred Partner)基因。 尽管mi R-28 的生物学功能研究尚不充分,但已有研究表明mi R-28 可参与 调控细胞增殖、分化和凋亡,并异常表达于骨髓增生异常综合征患者的血小板中 以及宫颈癌、结直肠癌患者的外周血中。最新研究证实,内含子型mi R-28 可直 接靶向抑制LPP基因的表达,而LPP 的生物学功能主要是促进细胞的迁移和粘附, 并在人类肿瘤中处于高表达状态。 值得关注的是LPP 被证实可促进受损血管平滑肌细胞的迁移和增殖,促进粥 样斑块的形成和发展,因此基于内含子mi R-28 与宿主基因LPP 的作用方式,我们 推测mi R-28 可能参与了动脉粥样硬化的病理过程,但具体作用机制除了可靶向 抑制LPP 基因的表达对其他靶基因和作用机制还尚不明确。本研究拟在体外细胞 学实验中选取和动脉粥样硬化发生机制较为紧密的Hep G2 和THP-1 分化的巨噬 细胞,采用瞬时转染的方法将mi R-28-5p 模拟物或抑制物转入细胞中获得高或低 表达的细胞模型。 结合生物信息学软件对mi R-28-5p 的靶基因进行预测,采用分子生物学技术 对Nrf2/Mad2/ERk2 进行验证,并拟选定ERK2 作为进一步探讨mi R-28-5p 生物学 功能的主要基因。通过实时定量PCR 和蛋白免疫印迹技术探求mi R-28-5p 是否 参与调控ERK2 介导的ABCA1 和LXR 介导的ABCA1/ABCG1 信号通路,从而进一步阐 明mi R-28-5p 在动脉粥样硬化发生、发展中的分子生物学作用。 根据前期体外细胞学实验基础及基因芯片分析发现在不稳定型心绞痛患者 血浆mi R-28-5p 可作为候选基因区分于表观健康成年人,并采用探针实时定量 PCR 技术检测mi R-28-5p 在不稳定型心绞痛与性别年龄匹配的表观健康成年人 血浆中的表达情况,分析其是否具有统计学差异表达或与临床指标是否具有相关 性。第一部分mi R-28-5p 生物信息学靶基因在Hep G2 细胞中的验证目的:在Hep G2 细胞中,筛选并验证Nrf2/Mad2/ERK2 是否为mi R-28-5p 的靶基因,为深入研 究mi R-28-5p 的生物学功能提供分子基础。 方法:应用生物信息学软件对mi R-28-5p 的靶基因进行预测和筛选,同时采 用Western Blot 方法对靶基因进行验证。结果：1 mi RNA-28-5p靶基因的生物 信息学预测目前对mi RNAs 生物信息靶基因的预测主要是通过应用生物信息学软 件进行预测,综合对Target Scan、Pic Tar、Mir Base 等多个生物信息学软件预 测的结果分析显示:mi RNA-28-5p属于3 号染色体,位于3q27-28。 本实验选取了预测p 值较低的ERK2/Mad2 作为下一步候选基因进行验证,同 时根据文献报道选用已被证实为mi R-28-5p 的靶基因Nrf2 作为对照,证实转染 实验的可行性(Table 1,2)。2 采用Western Blot 方法验证Nrf2 是mi R-28-5p 的靶基因我们应用Western Blot 方法对Nrf2 在Hep G2 是否为mi R-28-5p 的靶 基因进行验证。 本实验将mi R-28-5p 模拟物 mi R-28-5p 抑制物(mi R-28-5p mimic