2020碱裂解法抽提大肠杆菌质粒.pptVIP

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2020-12-07 发布于天津
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2020碱裂解法抽提大肠杆菌质粒.ppt

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实验一碱裂解法抽提大肠杆菌质粒 1 、实验目的：学习与掌握碱裂解法抽提大肠杆菌质粒 DNA 的原理与方法 2 、实验原理：碱裂解法抽提质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离的目的。 3 、实验步骤及各步注意事项 1. 取 1.4ml 大肠杆菌培养液 12000rpm 离心 2min ，弃上清，收集菌体。注意点：上清为培养基，必须尽量倾倒干净，并在吸水纸上吸干，如有较多培养基残留可能会影响后续实验。 2. 加 100μ l 的溶液 I ，使菌体充分悬浮，室温静置 3min 。注意点：必须充分混匀至看不见沉淀，可用移液器吹打或者用混匀器振荡。 3. 加入 200μ l 溶液 II ，温和上下颠倒 2-3 次，溶液转变为澄清透明。注意点：不可剧烈振荡。 4. 加入 150μ l 溶液 III ，上下颠倒混匀数次，静置 2-3min 。注意点：不可剧烈振荡，此时应出现白色沉淀。 5. 12000 rpm 离心 5min 。 6. 取上清，加等体积（ 400μ l ）的酚 / 氯仿 / 异戊醇，充分混匀，室温， 12000rpm 离心 5min 。注意点：酚氯仿有腐蚀性，盖严离心管盖，避免接触酚氯仿，如接触立即用水冲洗。 7. 吸上层水相，再加 1ml( 约 2.5 倍体积）预冷的无水乙醇，混匀。注意点：一定避免吸到中间沉淀及下层酚氯仿。宁可损失一定上清。