流式细胞术实验方法与具体应用.pptVIP

流式细胞术实验方法和具体应用 ; 科研型 分选功能 488nm激光 四色荧光 (525、575、610、675nm） ; 一、流式细胞术的原理;;FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）; 近30年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。;二、流式细胞术的特点、优点; 定性、定量分析细胞 　　通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高 　　荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。 ;流式细胞术的应用范围 细胞大小 细胞表面分子:CD系列 细胞浆内分子：胞内细胞因子 细胞核内分子：P53 细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡 其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度;常用荧光素;;常用荧光探针组合; 四、标本的收集、单细胞悬液的制备 骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等 ; 1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备 骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记，再溶血。;单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快 的特性（30-40min），可采用短时培 养获得较纯的单核细胞.; 2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞) 培养板 吸去培养液 PBS洗2次 胰蛋白酶 37℃，室温，3-5min 含血清的培养基 吹打 PBS洗2次 单细胞悬液。; 3. 组织器官单细胞悬液的制备 酶消化法 组织器官 单细胞制备仪 剪碎法 机械法 网搓法 研磨法 ;（1）、酶消化法 组织块洗去血液 剪成小块 胰蛋白酶 37℃，15-30min 含血清的培养基 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。 ;（2）、机械法 ???细胞制备仪 组织块洗去血液 剪成小块 制备仪 2-3min 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。 剪碎法 组织块洗去血液 剪至浆状 吸管轻轻吹打 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。 ; 网搓法 组织块洗去血液 100目钢筛网轻搓 生理盐水 收集滤液 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。 研磨法 组织块洗去血液 研磨器研至匀浆 100目钢筛网 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS洗2次 单细胞悬液。;4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备?;石蜡包埋组织制备?单细胞悬液 石蜡包埋组织切片 二甲苯脱蜡 1-2天 水化 乙醇，蒸馏水 组织器官 胰蛋白酶 37℃，15-30min 冰PBS 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液 ;5. 脱落细胞单细胞悬液的制备 包括： 尿液脱落细胞 胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞 ;收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 置 4℃ 冰箱中 沉淀 取底部10-20ml PBS洗 3 次 300目尼龙滤网过滤 单细胞悬液 收集方法、沉淀时间 胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝