第8讲 目的基因的表达与调控.pptVIP

8.3.5 酵母表达系统 ? 酵母（ yeast ） —— 是一类以芽殖或裂殖进行无性 繁殖的单细胞真核生物，是外源基因最理想的真 核生物基因表达系统。 酵母菌的特点： ? 基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于 1996 年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定； ? 具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统； ? 可将外源基因表达产物分泌到培养基中； ? 对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒； ? 可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。 8.3.5.1 酵母基因表达载体 ? 酵母克隆和表达载体是由酵母野生型质粒、原核生物质粒 载体上的功能基因（如抗性基因、复制子等）和宿主染色 体 DNA 上自主复制子结构（ ARS ）、中心粒序列 （ CEN ）、端粒序列（ TEL ）等一起构建而成。 ? 酵母基因表达系统的载体一般是一种 穿梭质粒 ，能在酵母 菌和大肠杆菌中进行复制。 8.3.5.2 酵母基因表达载体的种类 ? 自主复制型质粒载体 （ yeast replicating plasmid ， YRP ） ? 整合型质粒载体 （ yeast integration plasmid ， YIP ） 含有 酵母基因组的 DNA 复制起始区 、 选择标记 和 基因克隆 位点 等元件，能够在酵母细胞中进行自我复制。在酵母细胞 中的转化效率较高，每个细胞中的拷贝数可达 200 个，但经 过多代培养后，子细胞中的拷贝数会迅速减少。 不含酵母 DNA 复制起始区 ，不能在酵母中进行自主复制， 但含有整合介导区 ，可通过 DNA 的同源重组将外源基因整 合到酵母染色体上，并随染色体一起进行复制。质粒与染 色体 DNA 的同源重组主要有单交换整合和双交换整合两种 方式。 ? 着丝粒型质粒载体 （ yeast centromeric plasmid ， YCP ） 在自主复制型质粒载体的基础上， 增加了酵母染色体有 丝分裂稳定序列元件 。在细胞分裂时，质粒载体能平均 分配到子细胞中，稳定性较高，但拷贝数很低，通常只 有 1 ～ 2 个拷贝。 8.2.5 绝缘子 绝缘子（ insulator ）： ? 既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件； ? 它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动 子起增强或抑制作用； ? 绝缘子 抑制增强子的功能是有极性的 。它只能抑 制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子的作用， 而对处于同一结构域的增强子没有抑制作用； ? 绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程， 它是通过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产 生调控效应的。 8.2.6 反义子 ? 反义 RNA （ antisence RNA ）：同某种天然 mRNA 反向互补的 RNA 分子称为反义 RNA ，它是 由双链 DNA 中的无意义链转录产生的，可以用来 阻止被其转化的细胞中存在的与之互补 mRNA 的 转译活性。（ antisence techology ）。 ? 反义子：编码反义 RNA 的 DNA 称为反义子。 ? 反义子在 DNA 的复制、转录和翻译 三个水平对基 因的表达起调节作用，其中 以对蛋白质合成的抑 制最为普遍 。 复制水平的调节 ? 直接抑制 —— 反义 RNA 与引物 RNA 前体互补，使得引物 RNA 无法与 DNA 模板结合，进而抑制 DNA 复制的频率。 ? 间接抑制 —— 反义 RNA 通过阻断复制激活蛋白因子的合成 而间接抑制 DNA 的复制。 转录水平的调节 ? 反义 RNA 通过与 mRNA 的 5 ′ 端互补结合而阻止转录的延伸； ? 作用于 mRNA 的 poly(A) 区域，抑制 mRNA 的成熟及其运输； ? 与真核生物 mRNA 结合而影响其剪切加工。 翻译水平的调节 ? 通过与 mRNA 的 5 ′ 端 SD 序列结合，改变其空间构象，从而影 响核糖体在 mRNA 上的定位； ? 通过与 mRNA 的 5′ 端编码区（如起始密码）结合，直接抑制翻 译的起始。 SD 序列（ SD sequence ）： Shine-Dalgarno 序列的简称， 此为纪念最早发现该序列的研究者而命名的。 它是原核生物中核糖体的结合位点，亦即存在于 mRNA 分子 AUG 起始密码子之前的多聚嘌呤序列 AGGAGGG 的部分或全 部，可与 16S rRNA 的3′ - 末端序列互补。 SD 序列在核糖体同 mRNA 的结合过程中起重要作用。 8.3 外源基因表达系统 ? 外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导 入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因 产物（目的蛋白）。 外源基因表达系统 基因表达载体 受体细胞 基因表达系统 原核生物基因表达系统： 如大