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SDS检测重组蛋白 一、实验目的 掌握 SDS的基本原理； 掌握 SDS的凝胶制备方法； 掌握蛋白质的考马斯亮蓝染色法； 掌握测定重组蛋白分子量的方法。 二、实验原理： 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis）,简称PAGE，是以聚丙烯酰 胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（ acrylamide ）和甲叉双丙烯酰 胺（bisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。 催化剂过硫酸铵（AP） 可产生自由基，而加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）可催化过硫酸铵加速自由基的产生，这 样就可以形成丙烯酰胺长链， 同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交 联，从而形成交联的三维网状结构。 氧气对自由基有清除的作用， 在制备聚丙烯酰胺凝胶时 通常要进行抽气，或者用水或正丁醇隔绝氧气。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体的浓度来控制， 丙 烯酰胺的浓度可以在 3~30% （V/V ）之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如 3% （V/V ） 的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于 SDS的浓缩胶，也可以用 于分离 DNA 。高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白 质的分子量进行分离的电泳中，如 10~20% （V/V ）的凝胶常用于 SDS的分离胶。 聚丙烯酰胺凝胶具有以下突出的优点： （1）可以随意控制胶浓度和交联度， 从而得到不 同的有效孔径， 用于分离不同分子量的生物大分子； （ 2）能把分子筛作用和电荷效应结合在 同一方法中，达到更高的灵敏度： 10-9~10-12 mol/L ; (3)由于聚丙烯酰胺凝胶是由-C-C-键结 合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基 -CO-NH 2-，没有带电的其他离子基团，化学惰 性好，电泳时不会产生“电渗” ；( 4)由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重 复性好；( 5)透明度好，便于照相、扫描或复印。机械强度好，有弹性，不容易破碎，便于 操作和保存； ( 6)无紫外吸收，不需染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析； (7) 还可以用作固定化酶的惰性载体。 聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的， 后来发展起来的垂直平板电泳一 次最多可以容纳 20 多个样品，电泳过程中样品所处的条件比较一致，样品间可以进行更好 的比较， 重复性也更好， 所以垂直平板电泳目前应用得最更为广泛， 常用于蛋白质的分离和 分子量的测定，以及 DNA 序列分析过程中的 DNA 片段的分离和鉴定。 2、SDS 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)是根据SDS和还原剂将蛋白质分 子解聚后亚基的大小，在恒定 pH (碱性)缓冲体系中的分离。主要用于测定蛋白质亚基的 分子量。与超速离心、凝胶过滤相比， SDS不需要昂贵的仪器设备，操作简便，能在 几个小时内得到结果， 有较高的重复性， 且不需要非常纯的样品， 是目前为大家所接受的用 于测定亚基的分子量的一种最好的方法。 这个方法可用于多肽分子量的分析， 或用于变性蛋 白的分离等。 SDS 是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使 分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构。强还原剂，如 3■巯基乙醇、二硫苏 糖醇(DTT )则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入 SDS和还原剂 后，在100 C加热3~5分钟，分子被解聚为组成它们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。因此，结合了 SDS 的蛋白质可以在聚丙 烯酰胺凝胶中向正极泳动， 同时由于聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应， 蛋白质在凝胶中的迁移 率主要决定于自身分子量的大小，即分子量小的蛋白质分子通过凝胶孔的阻力小，迁移快， 而分子量大的蛋白质分子通过凝胶孔的阻力大，迁移慢。 SDS分离不同蛋白质时的高分辨率，不仅是因为聚丙烯酰胺凝胶介质本身的特 点，还归功于在电泳时采用了不连续系统。 不连续系统对样品具有浓缩效应， 从而提高了分 离效果。 凝胶层的不连续。浓缩胶的孔径大，分离胶孔径小，在电场的作用下，蛋白质颗 粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小， 移动快， 而在小孔胶中移动慢。 因而在两层凝胶交界处， 由于凝胶孔径的不连续性，使样品迁移受阻，而压缩成很窄的区带。 缓冲液离子成分及 pH 的不连续。在两层凝胶中均有 Tris (三羟甲基氨基甲烷) 及 HCl 。 Tris 的作用是维持溶液的电中性及 pH 值，是缓冲配对