A549DDP细胞凋亡与其机制的研究.docxVIP

A549/DDP 细胞凋亡及其机制的研究 材料 1.1 主要仪器 荧光显微镜及照相系统： Olympus 公司 垂直电泳槽： Bio-Rad 公司 电转移槽： Bio-Rad 公司 恒温摇床：江苏太仓仪器公司 分光光度仪： Bio-Rad 公司 遥控酶标仪： TECAN 公司 台式高速离心机： eppendorf公司 其余同前两部分 1.2 普通耗材 50mL/250mL 细胞培养瓶： Nunc 公司 6 孔细胞培养板： Costar 公司 60mm 细胞培养皿： Costar 公司 细胞刮刀： Nunc 公司 1.3 主要试剂 Hoechst33258染色试剂盒：碧云天公司 PI 和 Annexin V-FITC ：美国 BD 公司 TUNEL 试剂盒：罗氏公司 鼠抗人 Caspase-8 p10单抗： Cell Signaling HRP 标记羊抗鼠二抗：武汉博士德公司 BCA 法蛋白定量试剂盒： Pierce 公司 ECL 发光检测试剂盒： Pierce公司 硝酸纤维素转移膜 (0.22μm)Amersham 公司 DAB 北京中杉公司 其余试剂同前两部分 1.4 常用缓冲液及培养基 结合缓冲液 (×10)： 100 mmol/L HEPES(PH 7.5) 1.4 moL NaCl 25 mmol/L CaCl2 单去圬剂裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0) 150 mmol/L NaCl 1%TritonX-100 100 g/mL PMSF 5×SDS 蛋白上样缓冲液： 250 mmol/L Tris-HCl(PH 6.8) 10%SDS 50%甘油 0.5%溴酚蓝 500 mmol/L DTT( 临用前现加 ) 电泳缓冲液： 25 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 250 mmol/L 甘氨酸 (PH 8.3) 0.1%SDS 转移缓冲液： 5.6 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 120 mmol/L 甘氨酸 0.1%SDS 20%甲醇 (V/V) 储存于 4℃备用 PBS 缓冲液 137 mmol/L NaCl 2.7 mmol/L KCl 10.0 mmol/L Na2HPO4 2.0 mmol/L KH2PO4 调节至 PH=7.4 洗涤缓冲液 (PBS-Tween-20)： 1000 mL PBS(PH7.4,0.01M) 500μ L Tween-20 封闭缓冲液： 5 g 脱脂奶粉 100 mL PBST 1.5 细胞系 同第一部分 方法 2.1 A549/DDP 细胞凋亡的检测 2.1.1 细胞凋亡形态学观察 将 A549/DDP 细胞分别加入到含盖玻片的 6 孔细胞培养板中，每孔细胞数为 1×104 个，培养过夜后，去培养液，加入含姜黄素终浓度为 0、5、l0、20、30、40μmol/L 的培养液继续培养 24 h 后终止培养， 取出细胞爬片，按照 Hoechst33258染色试剂盒说明书进行染色。①在细胞爬片上，轻轻滴加约 500μL 固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定 10 分钟。 ②去固定液，用 PBS 洗两遍，每次 3 分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。 ③加入 0.5mLHoechst33258 染色液，染色 5 分钟，用手晃动数次。 ④去染色液，用 PBS 洗两遍，每次 3 分钟，吸尽液体，洗涤时用手 晃动数次。 ⑤滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片， 让细胞接触封片剂，避免气泡。 ⑥上荧光显微镜观察，激发波长 350nm，发射波长 460nm。 2.1.2 原位末端标记 (TUNEL) 染色 同上方法制备细胞爬片， PBS 洗涤，4%多聚甲醛固定后，按照 TUNEL 试剂盒说明书操作。 ①在细胞爬片上，轻轻滴加约 500μL 固定液，以刚覆盖爬片为宜， 固定 30 分钟。 PBS 洗片两次，每次 3 分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。滴 加内源性过氧化物酶阻断剂 (0.3%H2O2-甲醇溶液 )，室温孵育 30 分 钟。 ③同上用 PBS 洗片，滴加通透液 (0.1%TritonX-100 溶于 0.1%枸橼酸钠溶液中 )，在冰浴中孵育 2 分钟。 ④PBS 洗两次，滴加 50μL 的 TUNEL 反应混合液， 湿盒中室温孵育 分钟。 PBS 洗两次，滴加 50μL 的转化剂 -POD，湿盒中 37℃孵育 30 分钟。 ⑥PBS 洗两次，加入 DAB 底物溶液，室温孵育 10 分钟。 ⑦PBS 洗两次，封片。光镜下观察。 ⑧结果判定：细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。每张片至少观察500 个细胞，计算每 100 个细胞内的阳性细胞，即凋亡指数 (apoptotic index,AI) 。 2.