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实验五 质粒的转化及转化子的鉴定（ 8 学时） 实验目的 掌握热激法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。 实验原理 1）热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数 小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不 仅有利于离子和水进入细菌细胞， 也有利于 DNA 等大分子进入。同时 DNA 在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。 试剂与器材 1、试剂 质粒， LB 液体培养基 (Luria-Bertani) ，LB 固体培养基， 50mg/ml 氨 苄青霉素 ( Ampicillin ) 储存液， 2、器材 恒温摇床，台式低温离心机， 恒温水浴锅，超净工作台， 微量移液枪， eppendorf 管。 热激法转化实验步骤 1．制备选择性培养基平板：在融化的 250ml LA 培养基中加入 250μlAmp 100mg/ml ）， 250μl X-gal (20mg/ml) ， 25μl IPTG (200mg/ml) ，混匀后倒入灭菌培养皿中； 2．取出 3 管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； 3．每 100μ l感受态细胞加入约 20ng 质粒 DNA ， 3 管分别加连接产物、标准超螺旋质粒 DNA （阳性对照）及不加入任何 DNA （阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置 30 分钟； 4．热击：将离心管放置 42 ℃水浴，热击 90 秒，注意：勿摇动离心管； 1 5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置 1 － 2 分钟； 6．复苏：每管加 800μ lB 培养基，在 37 ℃ 摇床温和摇动温育 45 分钟，使 细菌复苏； 7．涂皿：取适当体积均匀涂布于含有抗生素（ Amp ）的 LB 平板； 8．培养：倒置培养皿，于 37 ℃ 培养 12 － 16 小时 即可观察到菌落。 注意事项 1．利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时， 用转化细胞铺平板的密度要低 （ 90mm 平板上不得超过 105 个菌落），同时 37 ℃ 培养不应超过 20 小时，具氨苄青霉 素抗性的转化体可将 β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。 2．鉴定转化子中是否含有外源 DNA 片段常用的方法有： ①α互补； ②杂交筛选； ③插入失活（一些老质粒如 pBR322 等） ; ④小量提取质粒，并酶切或 PCR 检测 思考题 ℃热击的作用是什么？ 2