红脂大小蠹耐寒相关基因筛选与表达分析.pdfVIP

摘要 摘要 红脂大小蠹 Dendroctonus valens LeConte 是我国林业重要的入侵害虫，主要以 幼虫钻蛀油松、樟子松等松树干部和根部危害，导致松树衰弱，甚至整株死亡。红脂 大小蠹主要以成虫和幼虫在松树树干基部及根部越冬，自 1998 年从美国传入我国山 西后，其分布区不断向北扩散，2017 年，在辽宁、内蒙和河北三省交界处大面积爆 发成灾，表现出较强的耐寒性。为明确红脂大小蠹成虫和幼虫在越冬过程中相关耐寒 基因及变化规律，本文以红脂大小蠹越冬期和非越冬期成虫、幼虫为研究对象进行高 通量测序，利用非模式生物差异转录组学分析方法，比较了两个时期成虫和幼虫的差 异表达基因，并进行了差异基因相关功能的分类鉴定和参与代谢通路的初步分析，初 步筛选了耐寒相关基因，转录组数据也得到了可靠性验证。主要结果如下： 1. 获得了不同时期红脂大小蠹成虫和幼虫转录水平的所有遗传信息。通过对越 冬期和非越冬期红脂大小蠹成虫和幼虫 12 个样本进行测序，共获得 86.32 Gb Clean Data ，各样品Clean Data 均达到 6.14 Gb 以上，Q30≥93.21%，Q20≥97.82 ％，GC 含 量平均占比为 42.98% 。利用软件 Trinity 对所有 clean reads 进行从头组装，共获得 110,932 个转录本，进一步聚类和去冗余优化组装得到 Unigenes 58,956 条，组装后转 录本平均长度为 1163.73 bp，N50 为 2101 bp ，BUSCO score 达 96.3% 。经NR 、Swiss- Prot 、KEGG 、COG、GO、Pfam 等数据库比对注释，有 28,218 条序列获得了已知生 物学功能注释，约占转录组文库所有 unigene 序列的 47.86% 。 2. 明确了不同时期红脂大小蠹成虫和幼虫的转录差异。与非越冬期相比，成虫筛 选获得 8260 条 DEGs ，幼虫筛选得到4996 条 DEGs ，成虫和幼虫共同表达的差异基 因有 1189 条，有 92 条差异表达基因在成虫和幼虫体内均上调。差异表达基因富集 分析显示，共同差异表达基因集中有 720 条基因获得 GO 注释，主要富集了“碳水化 合物代谢过程”、“肽代谢过程”、“细胞内细胞器”、“水解酶活性，作用于糖基键”和 “水解酶活性，水解 O-糖基化合物”等条目，说明温度对红脂大小蠹的代谢活动影响 较大。KEGG 代谢通路富集分析结果显示共同差异基因集中与碳水化合物代谢有关 的“戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化”、“半乳糖代谢”、和与运输分解代谢的有关的“溶 酶体”3 条途径得到显著富集，表明代谢调控在应对低温时很重要。 3. 初步筛选了红脂大小蠹体内可能与耐寒相关的基因。筛选得到 112 条基因， I 红脂大小蠹耐寒相关基因筛选与表达分析 主要是与冷冻保护剂合成降解相关的酶和蛋白基因，共计 44 条，其中包括 21 条小 分子多元醇的合成和代谢过程的基因，10 条参与海藻糖合成的基因，13 条合成低分 子氨基酸的基因。另外，注释到 1 条细胞保护蛋白 Hsp70 基因、11 条细胞骨架蛋白 基因、1 条与角质层形成相关基因、1 条抗氧化防御基因、15 条参与信号传导相关基 因、6 条细胞凋亡相关基因以及 31 条其他参与耐寒相关基因等。 4. 验证了红脂大小蠹转录组数据的可靠性。从可能与耐寒相关的候选基因中随 机挑选了 15 条做了 qPCR 的验证，结果表明 15 条差异表达基因的表达量变化趋势 与 RNA-seq 测序结果的表达量变化趋势完全一致，证实转录组数据可信，可以进行 后续分析。 综上所述，本研究获取了不同时期红脂大小蠹成虫和幼虫转录组数据，筛选出了 可能与耐寒相关的基因，研究结果丰富了红脂大小蠹的遗传信息，为后续红脂大小蠹 耐寒基因功能分析及耐寒机制的揭示奠定了分子基础，同时为从分子水平开展红脂 大小蠹行为调控以及防治新策略提供参考。 关键词: 红脂大小蠹；转录组；耐寒性；高通量测序；差异表达基因