酵母双杂交系统.docxVIP

酵母双杂交系统 1.原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发 现，许多真核生物的转录激活因子都是山两个可以分开的、功能上相互独立的结 构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4,在N端有一个山147 个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD), C端有一个山113个氨 基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)o GAL4 分子的 DNA 结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，而转录激 活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活 基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过 某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 试验流程 酵母双杂交系统正是利用了 GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋口在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋口质，其大致步骤为： 2. 1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait),将其与DNA结合域融合，构 建成诱饵质粒。 2. 2、将待筛选蛋口的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。 2. 3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2. 4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但 诱饵蛋口若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转 录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 特点 优点 蛋口-蛋口相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为 研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。 1、它并非对所有蛋口质都适用，这是山其原理所决定的。双杂交系统要求两种 杂交体蛋口都是融合蛋口，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋口相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性， 即指未能与诱饵蛋口发生作用而被误认为是阳性反应的蛋口。而且部分假阳性原 因不清，可能与酵母中其他蛋口质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源 蛋口将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的 前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设讣实验进程、才能有目的的进行材料准备，并 能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基的使 用LI的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别于其他 实验的特点，而其操作技术本身并不十分困难。特别应提出的是，一个阳性克隆 的编号往往要被反复记录多次，因此，要时时注意编号的正确性。另外，若从公 司购得待筛选的酵母cDNA文库，应注意不同的公司有不同的产品，且各公司 的产品不断更新换代，要认真阅读实验指导手册，以防出现失误。 4.应用 研究已知蛋口间的相互作用、寻找在蛋口一蛋口相互作用中起关键作用的结 构域、寻找与靶蛋口相互作用的新蛋口。相信随着分子生物学技术的发展与推广, 酵母双杂交技术在今后的蛋口质组学研究中将发挥更大的作用。 LcxA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op丄acZ的GAU UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情 况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3,可以作为有自主复制 能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3,在双杂交系统中用于表达DNA-BD（202个氨基酸残基组成 的LexA蛋白）与目标蛋白（钓饵，Bait）的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1 的调控，选择与报告基因的操纵子LexAX8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1,在其供外源基因插入的多克隆位点（EcoRI与Xho I）上游, 含有SV40核定位（SV40 nuclear localization）. HA（血凝素）及AD（来自于E.coli的88个氨基 酸残基组成的B42蛋白）等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。 在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu,它与LacZ报告基因具有相同的操 纵子-LexA,但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告 基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载