药用植物有效成分基因调控研究.doc1.pdfVIP

学习药用植物有效成分基因调控研究的心得 870 张敏 一、研究概况 实验生物学研究阶段 :放射性同位素标记的前体 蛋白质水平研究 :有效成分生物合成途径中酶 基因调控 :长春花 ,罂粟 ,紫草 ,青蒿 ,红豆杉 ,小檗 ,天仙子 ,蔓陀 罗等数十种 二、研究意义 植物 : 从分子水平上对其生物合成的关键基因进行调控 ,促 进其表达 ,可以提高目的产物的量 ,改变药用植物中各种成分之间 的比例 ,减少甚至完全去除某些有毒成分 ,只是栽培措施可望而不 可及的事 . 细胞培养技术 : 可增加有效成分生物合成过程中关键酶基 因的表达量 ,提高和稳定悬浮培养细胞有效成分的产量 ,培育高产 稳产的细胞系 ,从而彻底解决药用植物悬浮培养细胞有效成分产 量低不稳定的难题 ,真正实现利用药用植物细胞培养技术工业化 生产有效成分的目的 . 问题 : 有效成分的合成往往由多个酶促反应步骤并且是在 特定的分化了的细胞中完成的 .全面完成其生物合成 机理困难 , 大多数成分生物合成的分子机理都不清楚 . 三、基本理论和方法 首先要对药用植物有效成分生物合成途径进行研究 然后进行药用植物有效成分生物合成各酶促反应酶的提 取、分析、纯化及性质分析的研究 克隆、分离相应的基因并对其表达特征进行研究 最后利用转基因技术对有关基因进行人工调控。 四、药用植物有效成分生物合成途径 同位素标记的特定前体喂饲药用植物的植株。分离，纯化， 结 同位素标记的特定前体喂饲药用植构鉴定。物的培养细胞。 其相关的研究结果一方面可供整体植株有效成分生物合成途径 的研究时参考，并进行比较；另一方面，药用植株培养细胞有效 成分生物合成途径的研究结果还可直接应用于利用细胞培养工 业化生产有效目的成分的实践中。 五、参与药用植物有效成分生物合成相关酶的提取、 纯化及性质 分析 早年从分化的植物材料中提取粗提物。粗提物种酚类物质含 量高，且参与有效成分生物合成的酶的活性低。 如生物碱生物合 成早期前体往往是易变的酚类化合物， 而且生物碱的积累要经过 几个月甚至几年的时间才能达到一定的含量。 植物细胞培养不存在这些问题。药用植物的培养细胞十分均 一，目的产物的累积时间往往要比整体植株中目的产物的累积时 间短得多，特别是用诱导子处理培养细胞后有效成分的含量还可 进一步提高。 已经分离和鉴定了 80 多种参与生物碱生物合成的酶。 六、提取酶的存在形式 在代谢过程中分泌细胞或组织之外的胞外酶。 分布在细胞内部或是细胞的结构物的酶类，先要将细胞破 碎，才能将酶有效地提取出来。有时首先将细胞器、细胞碎片进 行分级分离，然后再提取。如参与生物碱生物合成的细胞色素 P450 存在于植物细胞微粒体中。 七、提取步骤 冻干燥，组织及细胞的破碎：捣碎法，匀浆法，研磨法，高 压匀浆器的挤压法。冷超声波振荡，渗透压冲击，酶解等。 酶的提取：低离子强度的盐溶液或提取缓冲液。如磷缓等。 细胞器的分离 叶绿体的分离：类萜的合成 微粒体的分离：生物碱的合成 八、酶的分离纯化 分离：盐析法，有机溶剂沉淀法 纯化：离子交换层析，凝胶层析，亲和层析 酶的性质分析：纯度，酶活力，酶促动力学（