《分子克隆》幻灯片课件.ppt

分子克隆;第五章 分子克隆;载体和目的基因的分离； 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。;基因重组技术的两个基本目的： 1.直接利用基因 主导生长的基因、 作物的抗性基因、 基因诊断、基因治疗、 指纹图谱等。 2.利用基因的表达产物 疫苗、药物、 组织激活物、 生长因子、 珍稀蛋白等。 ;工具酶：指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统。;工 具 酶;一、限制性内切酶 ○ 酶有几千种，分为6大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。 ○ 基因工程中常用作用于核酸的酶，包括水解酶、修饰酶、聚合酶等 水解酶分为内切酶和外切酶 ○ 内切酶在核酸链内部切割，生成寡核苷酸；外切酶从核酸链的末端开始，渐进式地水解核酸链，逐渐释放单核苷酸。 ;有特定的识别序列 但切割位置远离识别位置 有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割DNA分子 在基因工程中没有什么用途;Ⅲ型限制酶;Ⅱ型限制酶;限制性内切酶的命名;限制性核酸内切酶;第二节 分子克隆常用的工具酶;EcoRI酶切不同来源的DNA及退火重组;第二节 分子克隆常用的工具酶;第二节 分子克隆常用的工具酶;同尾酶：即识别序列不同，但酶切后产生同样的黏性末端的两种酶。;第二节 分子克隆常用的工具酶;限制性内切酶的主要用途;影响限制性核酸内切酶活性的因素： ;DNA连接酶;DNA连接酶功能 1.修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键。 2.修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键。 3. 连接多个平头DNA双链分子。 ; 从分子动力学的角底讲，由限制性内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末瑞则属于分子间的连接，因此后者速度要慢的多。 ;DNA聚合酶 基本性质; 缺口前移标记法制备32P标记的探针 Nick translation ;DNA聚合酶Ⅰ大片段 基本性质;DNA聚合酶Ⅰ大片段功能;T4-DNA聚合酶 基本性质;T4-DNA聚合酶功能 ;反转录酶reverse transcriptase;核酸酶S1;??酸酶S1功能 ;末端脱氧核苷酰转移酶 ;碱性磷酸酶 ;第三节 分子克隆常用的载体;载体应具备的条件;克隆载体—— 克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行繁殖，使 克隆的DNA片段数量大大增加 表达载体—— 将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达蛋白质 插入型载体— 将外源基因或DNA插入其中 置换型载体— 切除载体部分DNA，代之以外源基因或DNA。;质粒;质粒的命名;质粒与宿主细胞的关系;质粒发现和研究意义;质粒的分类;2.按分子量大小，分为2类 1）小型质粒，15kb 2)大型质粒15kb 小型质粒，无接合和自传递能力，在接 多属接合型或自传递型，大型质粒只 合质粒协助也能转移，也可心通过转化 能通过细菌的接合作用由一个细菌 作用进入受体细胞，这类质粒种类较多， 传到另一个细菌。（如F质粒）。 几乎每种细菌都可以含有2种以上，基因 工程一般用小型质粒。;3.按质粒转移方式，分为3类 1）接合型质粒（conjugaative plasmid）带有效接触基因质粒，只能使细菌接 合，本身不被传递. 2）可移动质粒（mobiliableplasmid）可以被传递，但不能使细菌接合。 3)自传递质粒（selftran missible plasmid）兼具1）2）两种功能因而可以自 传递，如F质粒。 ;质粒的功能;质粒的基本特性;质粒的构建 天然存在的质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点小、遗传标记不理想等缺点，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。;pSC 101 一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝,编码有一个四环素抗性基因（tetr）。 pSC101质粒不仅具有可插入外源DNA的多个限制性核酸内切酶的单克隆位点，而且还具有四环素抗性的强选择记号，因此，它被选为第一个真核基因的克隆载体。当然，这个质粒载体也有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA，其产量就要比其它质粒载体低