细胞内细胞因子流式细胞仪检测.docxVIP

细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 一、简介 随着研究的进展， 仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。 在单细胞水平研究细 胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。 目前检测单个细胞 特定细胞因子的表达手段包括： ELIspot 、原位杂交、 免疫细胞化学、 限制性稀释分析 （ limiting dilution analysis ， LDA ）和单细胞 PCR ，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子 蛋白表达及 mRNA 表达可以识别 Th1 和 Th2 细胞，此方法可获得较强的细胞内信号， 但此 方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而 ELISPOT 及单细胞 PCR 技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记 及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定 克隆细胞的激活。 尽管研究应用 T 淋巴细胞 克隆证明了不同细胞因子的合成，如 TH1(IL － 2， IFN － )与 TH2(IL － 4， IL－ 5，IL－ 10) ，但这些研究很难外推，因为 T 细胞 克隆 与体内 T 细胞功能相关性还未被揭示。 近来， Jung 与 Picker 采用了 monensin 、PMA 等药物预孵，用 Brefeldin(BFA) 、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集， 蓄积，增强细胞因子信号可被流 式细胞仪检测。 因为自然状态下， T 淋巴细胞产生少量的细胞因子， 通常要对 T 淋巴细胞体 外活化进行研究。在体外刺激过程中， T 淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因 子信号较弱， 难以进行检测。 这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子， 并可区分表达特定 细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在 1 型与 2 型分化， 且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。 且这些研究清楚地证明， 只有激活的细胞亚群 可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞 (T 、 B、 NK) 不能分泌细胞因子。 胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合， 即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌， 同时采用特殊的化学与抗体选择， 确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点： 快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需作时间为 1-2 小时，快速简便；  6-8  小时，实际操 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离 PBMCs ； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析； 安全：减少样本处理与生物源性污染 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。 二、所需仪器 1.流式上样管及 细胞培养 皿或板 2.25%CO 2 ， 37℃孵箱 混匀振荡器 4.离心机 加样器、 Tips 6.流式细胞仪 三、常用的标本类型和处理方法 全血 ：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、 EDTA 和 ACD 在 8 小时内分析，超过 8 小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少能在 8 小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。  抗凝剂，血样 5% 。如不 自身血浆中外周血单个核细胞  (PBMCs)  ：使用肝素钠抗凝的采血后，分离  PBMCs  ， 24  小 时内分析。 组织培养基中的外周血单个核细胞 (PBMCs) ：用 Ficoll 分离 PBMCs ，将细胞重悬于含 10% 热灭活胎牛血清 (FBS) 的 RPMI － 1640 培养基中，调节细胞浓度为 2× 10 6 细胞 /ml 。 细胞系与 T 细胞 克隆 ：调节细胞浓度 2 ×10 6 细胞 /mL 于新鲜培养基中。 冰冻全血与 PBMCs ：使用 1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者 PBMCs ，用 PBS 漂洗， 并用含 1% 的 BSA 及 10% 的 DMSO 的 PBS 重悬，－ 70℃冻存。 溶化后细胞置于染色管中，加上 2 ～ 3mL 的洗液，离心 5 分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。 四、所需试剂 1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂 依据实验需要选择特殊表面标志 CD45 圈定所有淋巴细胞 CD3 圈定 T 淋巴细胞 CD4 圈定 T 辅助淋巴细胞亚群 CD8 圈定 T 抑制淋巴细胞亚群 CD19/ 或 CD20 圈定 B 淋巴细