18种天然氨基酸分析（异硫氰酸苯酯柱前衍生法）.pdfVIP

HPLC Applications Dikma Technologies 18 种天然氨基酸分析(异硫氰酸苯酯柱前衍生法) ——序列号: D024 1 适用范围 该方法适用于氨基酸注射液、动植物性食品和饲料中Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨 酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙 氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(蛋氨酸)、Cys(胱氨酸)、 Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、 Lys(赖氨酸)等18 种天然氨基酸的检测 2 溶液配制 氨基酸储备液： 称取一定量氨基酸标准品，用0.1 mol/L HCl 水溶液溶解， 胱氨酸为0.01 mol/L ，酪氨酸为0.02 mol/L ，其他氨基酸 为0.05 mol/L 氨基酸使用液： 将储备液用0.1 mol/L HCl 水溶液稀释，得到浓度为0.002 mol/L 的氨基酸单标和混标 内标液： 以正亮氨酸作为内标物。称取一定量正亮氨酸，溶于0.1 mol/L HCl 水溶液，得到0.02 mol/L 的正亮氨酸内标液 异硫氰酸苯酯溶液： 将 250 μl 异硫氰酸苯酯用乙腈乙腈定容至 10 ml，得到 0.2 mol/L 异硫氰酸苯酯溶液 三乙胺溶液： 将1.4 ml 三乙胺用乙腈定容至10 ml，得到1.0 mol/L 三 乙胺溶液 3 衍生化 3.1 样品溶液衍生化 量取200 μl 样品溶液(蛋白质水解液或游离氨基酸溶液)[1] ，置于 1.5 ml 塑料离心 [2] 管中，加入20 μl 正亮氨酸内标溶液 ，混匀，再加入100 µl 1 mol/L 三乙胺乙 腈溶液和100 µl 0.2 mol/L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，室温反应1 小时，然 HPLC Applications Dikma Technologies 后加入400µl 正己烷，旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s ，静置分层，取200 µl 下层 [3] 溶液与800 µl 水混合 ，0.22 µm 针式过滤器过滤，待分析。 3.2 标准溶液衍生化 量取200 µl 氨基酸混合标准溶液(每种组分浓度均为0.002 mol/L) ，置于1.5 ml [2] 塑料离心管中，准确加入20 μl 正亮氨酸内标溶液 、100 µl 1 mol/L 三乙胺乙腈 溶液和100 µl 0.2 mol/L 异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，室温反应1 小时，然后 加入正己烷400 µl ，旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s ，静置分层，取200 µl 下层溶 液与800 µl 水混合[3] ，0.22 µm 针式过滤器过滤，待分析。 注： [1] 通过控制原始样品质量或稀释等方法，使样品溶液中的氨基酸总量不超过0.04 mol/L 或 3.0 g/L(两者中取最小值) [2] 只有采用内标法分析时，才需要加入正亮氨酸作为内标物 [3] 衍生得到的样品溶液中含有50%的乙腈，这与流动相溶剂体系存在较大差距，因而需要 加水稀释，否则会引起峰前沿或分叉 4 分析条件 色谱柱: Diamonsil AAA 氨基酸分析柱，250 ×4.6 mm ，5 μm 流动相A: 0.05 mol/L 乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH 值为6.50 ± 0.05) 流动相B: 甲醇 : 乙腈 : 水=20 : 60 : 20(V : V : V)