生物反应工程实验讲义2.pdfVIP

精品文档就在这里 各类专业好文档，值得你下载，教育，管理，论文，制度，方案手册，应有尽有 -- 实验二 未反应酶失活动力学曲线的制作 一、目的 1. 巩固 HRP 酶活力测定的方法； 2. 掌握未反应酶失活动力学曲线制作的方法； 3. 进一步熟悉过氧化物酶的特性。 二、原理 酶是一种不稳定物质，常因温度、 pH 等因素的影响而产生不可逆的活性下降。一般胞 外酶较为稳定，而胞内酶在外部环境中容易失活。酶失活，是酶的又一个重要特性。 在一定条件下，使酶溶液恒温保持一定时间，定时取样，然后在 pHopt 和 Topt 下，测 定残存酶活，以时间为横坐标，相对活力为坐标，绘制的曲线为酶失活动力学曲线。 三、试剂、仪器： 1. 试剂： 酶制剂：辣根过氧化物酶，配制适当浓度。 0.02 mol/L 愈创木酚溶液：取 0.22ml 愈创木酚加水至 100 ml 。 0.04 mol/L H 2O2 溶液：取 0.4ml 30% H 2O2 加水至 100 m l 。临用前配制。 pH6.0 0.05mol/L 的磷酸缓冲溶液， pH7.0 0.2mol/L 的磷酸缓冲溶液。 2. 仪器： 722S 分光光度仪 电子天平 恒温水浴锅 秒表 微量可调进样器 离心管等 四、步骤： 取离心管 15 支，按照 1～7 的顺序逐管重复两组编号， 空白为 0 号，各管内加入 0.5ml 酶 液；放入 70℃恒温水浴锅内，水浴的热处理时间分别为 0 、10、20、30、40 、50 、60、0min ， 取出后立即用流动水冷却至室温。 在 25 ℃、pH7.0 条件下测定其活力。以 0号管作空白，在 722S型分光光度计 470nm波长处 读取各管的吸光度 A470 。 整个操作过程见表 4 。 五、记录与数据处理 1.记录； 用秒表记时，每隔 10S 读数。 精品 文档 精品文档就在这里 各类专业好文档，值得你下载，教育，管理，论文，制度，方案手册，应有尽有 -- 2. 数据处理： 每分钟 A470 增加 0.001 所需酶量定为 1 个 HRP 。 相对活力 = （零时刻热处理酶活力 /任意时间酶活力）× 100% 3. 反应酶失活动力学曲线的制作 以处理的时间为横坐标，酶的相对活力为纵坐标作图。 表 2 未反应酶失活动力学曲线的制作 管 1 2 3 4 5 6 7 0 1-1 1-2 2-1 2-2 3-1 3-2 4-1 4-2 5-1 5-2 6-1 6-2 7-1 7-2 号 酶液 ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 水浴 80℃ 温度 水浴时 0 0 10 20 30 40 50