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专题一基因工程 1. 1 DNA重组技术的基本工具 一、 基因工程的基本概念 概念：基因工程是指按照人们的愿望，进 行严格的设计，并通过 和 等技术，赋予生物以新的 ，从而创造出更符合人们需要的 新的 和 。由于基因 工程是在DNA分子水平上进行设计和施工 的，因此又叫做 。 基本原理： 理论基础 不同生物的基因可以拼接的结构基础一 一细胞生物的遗传物质都是 ,都是 以 为基本单位构成的双链大 分子。 目的基因转入后可以表达的基础一一所 有生物共用一套 。 生物遗传信息的表达都遵循 c 优点 目的性强，能 的改造生物的性 状。 克服 的障碍。 二、 限制性核酸内切酶一一分子手术刀 简称： 。 来源：主要是从 中分离纯化 而来。 功能特点：特异性，即识别双链 DNA 分子某种特定 ,并且使每一条链 中 的两个核昔酸之间的 断开。 酶切结果: 末端和 末端。 画出EcoR I酶切后的结果： I GAATTC CTTAAG 三、DNA连接酶——“分子缝合针” 作用实质：将双链 DNA片段“缝合” 起来，恢复被限制酶切开了的两个核昔酸之 间的 。 作用前提：两个DNA分子必须含有 种类 E - coli DNA 连接酶 来源： 功能：只能连接 ⑵T 4DNA连接酶 来源： 功能：既可以连接 ,又可以 连接，但连接 时效率 比较低。 【拓展】 比较DNA连接酶与DNA聚合酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 作用 实质 都是催化两个核昔酸之间形成 是否 需模板 连接 DNA链 链 链 作用 过程 在两个DNA 片段之间形 成 将 加 到已存在的核昔 酸链上，形成 作用 结果 将两个DNA 片段连接成 合成 四、基因进入受体细胞的载体一一“分子运 输车” 基因工程中最常用的载体一一 来源：等微生物 结构：裸露的、结构简单、独立于 之外，并具有 的 分子。 基因的载体必须具备的条件 （1）有 个限制酶切割位点， 供外源DNA片段（基因）插入其中。 ⑵能在宿主细胞内 ，或整合到染 色体DNA上，随染色体DNA进行 （3） 有特殊的 ,如四环素抗性 基因等，供重组 DNA的鉴定和选择。 （4） 必须是 的，不会对受体细胞有害。 （5）适合，以便提取和在体外进行操 作。 载体的种类：除质粒外，还有 在进行基因工程操作中，真正被用作载体 的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过 的。 1. 2基因工程的基本操作程序 一、基因工程的基本操作程序 的获取。 的构建。 将目的基因 目的基因的 二、目的基因的获取 目的基因主要是 的结构基因。 获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取目的基因 ①基因文库概念：将含有某种生物不同基因 的许多 ,导入 的群体中 储存，各个 分别含有这种生物的不 同的基因，称为基因文库。 ②基因文库分类：可分为 文库和 文库（如cDNA文库）。 ⑵ 利用PCR技术扩增目的基因 ①PCR技术是 的缩写。 PCR是一项在生物体外 的 核酸合成技术。 ②PCR技术的原理：DNA 的 。 PCR扩增的前提：要有一段已知目的基 因的 ,以便根据这一序列合成引物。 PCR扩增的条件：、（目的 基因）,原料 （ 即 dCTP、dATP、dGTP、dTTP）,耐高温的 酶（Taq 酶）。 PCR扩增的过程 变性：加热到90-95 C, DNA受热变性后 复性（退火）：冷却到55-60 C, 与 结合 延伸：加热到70-75 C ,在热稳定的 （Taq 酶）的作用下进行延伸 结果：目的基因以 的方式成指数形式 扩增。 ⑶人工合成法：如果基因比较—，且 ,可以通过 用化学方 法直接人工合成。 【拓展】PCR技术和DNA复制的比较 PCR技术 DNA复制 相 原理 同 原料 点 条件 、 __ _ 、 解旋 解旋 催化 不 同 点 场所 复制］ 酶 热稳定的 细胞内含有的 DNA聚合酶 DNA聚合酶 结果 在短时间内形 成 形成 三、基因表达载体的构建 基因表达载体的构建是实施基因工程的第 二步，也是基因工程的 基因表达载体构建目的：使目的基因在受 体细胞中 ,并且可以 给 下一代，同时，使目的基因能够 。 基因表达载体的组成：除了目的基因外， 还必须有 、 以及 启动子：位于目的基因的 ,是一 段有特殊结构的 DNA 序列，是 识别和结合的部位，有了它 才能驱动基因转录出 mRNA ,最终获得所需 的蛋白质，即转录开始的部位。 终止子：位于目的基因的 ,也是 一段有特殊结构的 DNA序列，使转录在所需 的地方停止下来，即转录停止的部位。 标记基因：用于鉴别受体细胞中是否 ,从而将含有目的基因的细胞 出来，常为 ,如氨 苯青霉素抗性基因、四环素抗性基因。 表达载体构建过程中，获