冬凌草甲素抑制金黄色葡萄球菌及其生物膜形成的机制.pdfVIP

摘要 摘 要 金黄色葡萄球菌是常见的重要人类病原菌，易污染禽类、肉类和奶制品等蛋 白含量丰富的食品，也易在食品及加工器具表面形成生物膜，引起食品腐败和疾 病的传播，威胁人类健康。预防金黄色葡萄球菌感染也成为人们研究的热点，目 前大多采用化学杀菌剂。但由于细菌耐药性变强，人们急需寻找一种新的天然抑 菌防腐剂来代替化学杀菌剂。本文通过研究冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的细胞 膜通透性、蛋白质合成和呼吸代谢，以及对金黄色葡萄球菌生物膜形成的细胞间 多糖黏附素的合成、胞外 DNA 的释放和生物膜形成相关 icaA 、cidA 、agrA 和 sarA 基因表达量的影响，探讨冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌及其生物膜形成的 抑制机制，为其在为其在食品行业和畜牧业中治理金黄色葡萄球菌生物膜问题提 供一定理论基础。主要研究结果如下： （1）采用二倍稀释法研究了冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度 和最小杀菌浓度，并考察了温度、pH 和紫外处理对冬凌草甲素的抑菌活性的影 响。试验结果显示，冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓 度分别为25 μg/mL 和50 μg/mL ；加热处理冬凌草甲素对其抑菌活性具有提高的 作用，90℃处理 30 min ，冬凌草甲素的抑菌活性仍高于对照组；中性和酸性环 境对冬凌草甲素的抑菌活性有一定的提高作用，但碱性环境冬凌草甲素的抑菌活 性降低；短时间的紫外线处理并不影响冬凌草甲素的抑菌活性，但紫外线处理时 间大于15 min，其抑菌活性呈现下降趋势。 （2 ）采用分光光度计和 SDS技术研究了冬凌草甲素对金黄色葡萄球 菌细胞膜的通透性、呼吸代谢途径和蛋白质合成能力的影响。试验结果显示，冬 凌草甲素作用金黄色葡萄球菌后，培养液的电导率升高，β-D-半乳糖苷酶活性增 高，核酸外泄量也增加，2MIC 药物组处理 6h 后的电导率比空白组升高了 17% （P0.01 ），处理 12h 后的 β-D- 半乳糖苷酶活性比空白组提高了 54% （P0.01 ），胞外核酸大分子含量显著高于对照组 （P0.01 ）；冬凌草甲素作用 金黄色葡萄球菌 9h ，菌体可溶性蛋白质总量比对照组减少了 50% （P0.01 ）； 冬凌草甲素能抑制金黄色葡萄球菌三羧酸循环中的关键酶活性，其中对苹果酸脱 氢酶活性抑制率为 53.22% （P0.01 ），对琥珀酸脱氢酶的活性抑制率为 33.96% （P0.01 ）。试验结果表明冬凌草甲素通过破坏细菌细胞膜的通透性，抑制菌体 内的蛋白质合成和代谢关键酶的活性发挥杀菌作用。 （3 ）采用结晶紫染色法研究了亚抑制浓度的冬凌草甲素对金黄色葡萄球菌 生物膜形成的影响。试验结果显示，与对照组相比，在 1/2MIC 和 1/4MIC 冬凌 I 摘要 草甲素作用下，金黄色葡萄球菌生物膜形成量分别下降了 61%和 50% ，差异极 显著 （P0.01 ）；在 1/8MIC 冬凌草甲素作用下，金黄色葡萄球菌生物膜形成量 也下降了 19%，差异显著 （P0.05 ）。扫描电镜观察结果也显示，未添加冬凌 草甲素的对照组菌体聚集成团，连成一片；而药物处理组金黄色葡萄球菌生物膜 的形成量则随着冬凌草甲素浓度的增大而降低，冬凌草甲素含量为 1/2MIC 时， 细菌多呈分散状态，部分聚集一起，但没有出现堆叠成团的现象。试验结果表 明，冬凌草甲素能抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成。 （4 ）采用刚果红平板法和分光光度法研究了冬凌草甲素抑制金黄色葡萄球 菌生物膜形成的机制。试验结果显示，冬凌草甲素能抑制金黄色葡萄球菌生物膜 中 PIA 的合成和 eDNA 释放量，与对照组相比，1/4MIC 冬凌草甲素作用 16 h 后，金黄色葡萄球菌eDNA 的释放量降低了48.62% ，差异极显著 （P0.01 ）。 （5 ）采用 RT-PCR 技术研究了冬凌草甲