DB15T 2044-2020农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程.pdfVIP

ICS 65.020.20 CCS B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2044—2020 农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程 Technical code of practice for Agrobacterium-mediated Sugarbeet Genetic Transformation 2020-12-24 发布 2020-01-24 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2044—2020 4.2 诱导分化培养基 用于甜菜无菌苗诱导分化培养和甜菜叶片-叶柄的预培养。成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖 30 g，NAA （萘乙酸）0.7 mg，KT （激动素）1.2 mg，琼脂粉7 g，pH=5.8。 4.3 生根培养基 用于甜菜无菌苗的生根培养。成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖30 g，NAA 1.2 mg，琼脂粉 7.5 g，草甘膦0.08 µM，pH=5.8。 4.4 YEP 培养基 用于工程农杆菌的增值培养。成分为（1 L）：牛肉浸膏5 g，酵母提取物10 g，氯化钠5 g，琼脂 粉15 g，rif （利福平）50 mg，kan （卡娜霉素）50 mg，pH=7.0。 4.5 侵染液培养基 用于加入农杆菌菌液配制侵染液。成分为（1 L）：MS 培养基 4.74 g，蔗糖 30 g，NAA 0.7 mg， KT 1.2 mg，AS(乙酰丁香酮)150 µM，pH=6.8。 4.6 共培养培养基. 用于侵染后甜菜叶片-叶柄与农杆菌的共培养。成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖30 g，琼脂 粉7.5 g，AS 150 µM，NAA 0.7 mg，KT 1.2 mg，pH=5.8。 4.7 脱菌培养基 用于共培养后的脱菌。成分为（1 L）：MS培养基 4.74 g，蔗糖30 g，琼脂粉7.5 g，cef （头孢霉 素） 500 mg，kan 50 mg，pH=5.8。 4.8 筛选培养基 用于甜菜转化后的筛选培养。成分为（1 L）：MS培养基4.74 g，蔗糖30 g，琼脂粉7.5 g，草甘膦 0.08 µM，pH=5.8。 5 灭菌 5.1 灭菌前准备 制备75 %酒精、0.1 %升汞、无菌水。 5.2 种球灭菌 将甜菜种球磨光，用百菌清 （烟剂型）密闭熏蒸24 h后，在超净工作台中移至灭过菌的三角瓶中， 随后用75 %酒精消毒2 min，无菌水漂洗3 次，接着用0.1 %的升汞处理20 min，无菌水漂洗3 次，最后 将消毒后的种子接种于琼脂粉培养基上，每三角瓶（100 ml）25粒。 6 无菌苗培养 6.1 种球萌发 2 DB15/T 2044—2020 从筛选培养基中取出抗性芽，切成1 cm～2 cm的单芽，接种到生根培养基中，培养环境：温度25 ℃， 光照强度3000 Lux，光照时间14 h。20 d～30 d即可诱导出新生根。 10 移栽 10.1 炼苗 去掉封口膜，在组培室锻炼2 d～3 d。 10.2 室内移栽 选择根系生长健壮的组培苗从三角瓶中移出，用自来水浸泡根部12 h，洗净根部残留培养基，移栽 到花盆中（育苗土由蛭石和田园土构成，二者比例为1:1），并遮阳，定期浇水，室内培养7 d～14 d。 10.3 大田移栽 待盆栽幼苗生长至4-6 片真叶时，平均气温稳定在10 ℃以上时，选择早上或者傍晚移入大田。 11 目的基因检测 11.1 PCR 扩增检测 在组培苗进行筛选培养期间，提取组培苗基因组DNA，对目的基因进行PCR扩增，扩增结果有目的基 因条带的说明目的基因转入组培苗并成功表达，没有目的基因条带的说明目的基因没有转入组培苗。 11.2 涂抹草甘膦检测 使用浓度为 1.4 ml/L （大田除草使用浓度）的草甘膦溶液涂抹甜菜叶片，10 d后对照非转基因甜 菜的老叶出现退绿、新叶萎缩畸形等药害反应。而转基因甜菜植株仅有个别新生叶片出现轻度萎缩的轻 微