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弓形虫中腺苷酸琥珀酸裂解酶和腺苷酸激酶的生物学功能的研究 目录 摘 要I ABSTRACT III 缩略语表 V 1．文献综述 1 1.1 弓形虫综述 1 1.1.1 弓形虫 1 1.1.2 弓形虫的基因型与毒力 1 1.1.3 弓形虫与宿主的免疫反应 2 1.2 弓形虫疫苗研究进展 3 1.2.1 灭活疫苗及弱毒活疫苗 4 1.2.2 基因缺失减毒活疫苗 4 1.2.3DNA 疫苗 5 1.2.4 亚单位疫苗 6 1.3 弓形虫嘌呤核苷酸代谢的研究进展 6 1.3.1 弓形虫嘌呤的获得 6 1.3.2 腺苷酸激酶（AK ） 7 1.3.2 次黄嘌呤黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXGPRT ） 8 2 ．研究目的与意义 9 3 ．材料与方法 10 3.1 实验材料 10 3.1.1 实验动物 10 3.1.2 实验菌株、虫株与细胞 10 3.1.3 载体与质粒 10 3.1.4 引物 11 3.2 主要仪器与试剂 12 3.2.1 主要仪器 12 3.2.2 主要试剂盒 12 3.2.3 主要试剂 13 3.2.4 主要溶液的配制 13 3.3 实验方法 15 I 华中农业大学2020 届硕士研究生学位论文 3.3.1 弓形虫的体外培养15 3.3.2 弓形虫基因组DNA 的提取15 3.3.3 弓形虫RNA 的提取16 3.3.4 弓形虫cDNA 的制备16 3.3.5 相关质粒的构建17 3.3.6 His-ADSL 重组蛋白的原核表达20 3.3.7 His 融合蛋白的纯化20 3.3.8 纯化蛋白的透析与保存20 3.3.9 BCA 法测蛋白质浓度21 3.3.10 ADSL 原核表达蛋白\免疫血清样品Western-blot 鉴定21 3.3.11 免疫兔制备多克隆抗体22 3.3.12 ADSL 及AK 敲除株的构建及鉴定22 3.3.13 复制试验23 3.3.14 弓形虫虫株毒力试验以及毒力梯度实验24 3.3.15 ELASE 检测小鼠血清/IgG 抗体24 3.3.16 小鼠脑包囊计数25 3.3.17 空斑试验25 3.3.18 小鼠体内荷虫量实验26 3.3.19 荧光定量PCR （qPCR ）实验26 3.3.20 小鼠免疫保护实验26 3.3.21 免疫小鼠脾细胞悬液的制备27 3.3.22 小鼠血清和脾细胞培养上清细胞因子的检测27 4 ．结果与分析27 4.1 ADSL 和AK 基因的缺失株和ADSL 回补虫株的获得以及功能鉴定27 4.1.1 ADSL 和AK 基因CRISPR 质粒的构建27 4.1.2 ADSL 和AK 基因同源模板质粒的构建28 4.1.3 构建ADSL 和AK 敲除株29 4.1.4 ADSL 敲除株体外生长实验31 4.1.5ADSL 缺失导致弓形虫毒力减弱和脑包囊数量减少32 4.1.6 Com-ADSL 虫株的构建以及鉴定32 4.2 ADSL 、AK 双敲除虫株的构建及功能研究34 4.2.1 ADSL 、AK 双缺失虫株的构建34 4.2.2 ADSL 、AK 双缺失虫株的功能研究35