3章.载体总结剖析.docxVIP

·作为一个理想的载体，应具备以下条件： 1.具有对受体细胞的可转移性 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 3.具有多种单一的核酸酶切位点 4.具有合适的选择标记 5.具有较好的安全性，不能任意转移 6.具有较高的外源 DNA 的载装能力 ·克隆载体（ cloning vector ）：主要是对目的基因克隆，建立 DNA 文库和 cDNA 文库，其上 有复制子即可； ·表达载体（ expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既 有复制子，更要有强启动子； ·穿梭载体 （ shuttle vector ）：这类载体可以在原核细胞中复制， 也可在真核细胞中扩增和表达。 ·细菌质粒 (plasmid) 包括三种组成部分： 复制必须区、选择标记基因、限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点，  MCS). ·质粒 DNA 分子具有三种构型： 超螺旋共价闭环 DNA ， cccDNA ， SC 构型 开环 DNA ， ocDNA ，OC 构型 线性 DNA ， cDNA ， L 构型 ·严紧型和松驰型质粒 严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有 1～3 个 松驰型质粒：其拷贝数较多，一般 20～ 60 个，多的可达 200～ 300 个 ·转移型和非转移型质粒 转移型，结合型（ conjugative plasmid ）是指一些质粒在不同的菌株中可以相互转移 非转移型质粒 (non-conjugative plasmid) 则只能在一种寄主中生存（常用于构建克隆载体） ·质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒， 不能同时存在于一个细胞中， 这种现象称为质粒的不相容性。 ·人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（ plasmid）的第一个字符  p，用小写。  p 后 有 2 个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。 ·实验室一般使用下列三种方法制备质粒 DNA ： ①氯化铯密度梯度离心法：质粒 DNA 纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；②碱裂解法（最常用） ：质粒 DNA 纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间；③沸水浴法：质粒 DNA 纯度底、快速、操作简便。 1.pSC101 质粒载体 结构：编码一个四环素抗性基因（ Tetr）；有多个单一的酶切位点。 特点：严紧型低拷贝质粒，每个细胞仅有 1~2 个拷贝，所以 DNA 产量低；插入 3 个位点， Tetr 会失活；具有可插入外源 DNA 的 EcoRⅠ单克隆位点，且不影响其功能。 2.ColE1 质粒载体 优点：①能产生大肠埃细菌素，还编码使宿住细胞对大肠埃细菌素 E1 免疫性的基因 ②有 EcoRⅠ的单一切割位点 ③松弛型复制子，几乎是所有人工质粒的组成元件 缺点：以大肠埃细菌素免疫性作为选择标记的体系存在较大的缺陷 3.pBR322 质粒载体（应用最广） 组成：①来自 pSCl01 的四环素抗性基因 Tetr ②来自 ColEl 的衍生物 pMBl 的松弛复制起点 ori ③来自 pSF2124 的氨苄青霉素抗性基因 Amp r 特点：①具有较小的分子量（ 4363bp） ②具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号 ③利用 ColEl 的复制子在细胞中是多拷贝的， 可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增 缺点： pBR322 质粒上的 EcoRⅠ位点不会发生插入失活，而 EcoRⅠ酶又是基因工程中最常 用的一种核酸内切限制酶 4.pUC 质粒载体 ·在 pBR322 质粒载体的基础上，加入了一个在其5’端带有多克隆位点的 LacZ 基因。 组成：①来自于 pBR322的 Ori （复制起点） r ②氨苄青霉素的抗性基因 (Amp ) ，但核苷酸序列发生了变化 ③ LacZ ′基因，编码 β —半乳糖酶的 α—肽链即氨基末端 ④位于 LacZ′基因的靠近 5’端的一段 MCS区段，但不破坏该基因的功能 ·与 pBR322相比， pUC 质粒载体优点： ①具有更小的分子量和更高的拷贝数 ②适用于组织化学法检测重组体（通过 α- 互补作用，利用菌落颜色筛选重组子） ③具有多克隆位点区段（ MCS），可以定向克隆防止载体自我连接。 ·β - 半乳糖苷酶筛选系统 载体上带有一个来自大肠杆菌的 Lac 操纵子的 DNA区段，这一区段编码 β - 半乳糖苷酶氨基 端的一个蛋白片段。 IPTG 可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的 β - 半乳 糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补（ α - 互补）。故暴露于诱导物 IPTG 的细菌与含有编码 LacZ’的质粒可同时合成该酶的两种片段， 该菌在其生色底物 X-gal 的培养基上生长， 将形 成蓝色