色谱简述及血浆分离分析.pptVIP

色谱分析过程 步骤 预处理 标准曲线 色谱分析 样品检测 进一步检测 效果检验 回收率 检出限 进样 色谱分析过程 步骤 预处理 标准曲线 色谱分析 样品检测 进一步检测 效果检验 回收率 检出限 进样 常用色谱分析方法 气相色谱(GC) 用于多种理化性质相近的药物分离进行定性定量分析，主要针对挥发性物质，相对便宜方便易普及。 如：乙醇，常见毒品，脂肪酸 01 高效液相色谱(HPLC) 治理药物监测最常用的方法，可同时进行几种药物定性定量分析和药动学。 对于GC不能分析的高熔点，低挥发性，极性强，热不稳定物质可以适用。 常用方法： ①反相高效液相色谱(RP-HPLC)，应用最广泛，如：各种氨基酸、叶酸(维生素)、大部分药物监测(抗生素——头孢哌酮钠、伏立康唑，心血管药——丙吡胺及其代谢物、萘呋胺，抗癌药——5-Fu，探针药——咖啡因，咪哒唑仑及代谢物) ②亲水相互作用(HILIC)，如：赖氨酸，NKK及代谢物(致癌物质) （如第一部分，血红蛋白用亲和层析/离子交换色谱) 检测器： ①紫外（适用多数物质有紫外吸收，检测限1ng）,如：5-Fu ②荧光（适用能产生荧光的物质，检测限0.1ng），如：萘呋胺，半胱氨酸 ③电化学（适用儿茶酚胺和含酚性基团的药物及代谢产物） 02 液质联用(HPLC-MS) 研究复杂成分药物体内代谢更敏感特异高效，无需大量对照品，昂贵操作复杂，短期内难普及。 多选用电喷雾正离子模式(ESI+),多反应监测(MRM) 其他联用还有高效液相色谱一核磁共振联用(HPLC—NMR)、气相色谱一质谱联用(GC—Ms)等。 如：HILIC-MS/MS：NKK及代谢物，GC—Ms：多种常见毒品，RP-HPLC-MS/MS：咖啡因，咪哒唑仑及代谢物。 03 色谱分析过程 步骤 预处理 标准曲线 色谱分析 样品检测 进一步检测 效果检验 回收率 检出限 进样 色谱分析过程 步骤 预处理 标准曲线 色谱分析 样品检测 进一步检测 效果检验 回收率 检出限 进样 萃取效果检验（文献中） 回收率 日内、间变异系数RSD 检出限 分析时间 原理 萃取样品与同浓度非萃取样品峰面积之比 日内：争取5％以内，不能超过10% 日间：要求在15%以内 给定置信度内可检出待测物质的最小浓度或最小量 各种氨基酸 98% 0.5-2.9%(n=5) 0.2-1nmol 25min 脂肪酸 86-100% 日内0.69-5.05% 日间0.44-4.62% 100-300ng/mL (预处理)+15min 各种常见毒品 96-103% 1.64-6.32% 0.05mg/kg 18min 药品(伏立康唑) 99-103% 日内3.2-4.0% 日间2.6-3.8% 0.1mg/L 10min 色谱分析过程 步骤 预处理 标准曲线 色谱分析 样品检测 进一步检测 效果检验 回收率 检出限 进样 进样 过程图 进样方法: ①直接进样 适合RC-HPLC，样品浓度大，蛋白含量少，无污染 GC应用快速，但容易污染和堵塞 ②顶空气进样/液上相[GC] 2mL全血分析（由于乙醇在固液两相分配比不等同）→ 恒温水浴60min（乙醇在气液两相间分配）→ 分配平衡后，取60μL顶空气进行分析 ③沉淀蛋白进样 甲醇、乙腈、三氯醋酸，使用极性很大的目标物 进样量： 1-20μL 定性及定量检测分析血液中乙醇检测专用气相色谱仪 色谱分析过程 步骤 预处理 标准曲线 色谱分析 样品检测 进一步检测 效果检验 回收率 检出限 进样 预处理 目标：去除杂质，提高分析精度和分离效果；提高检测灵敏度；提高样品与流动相兼容性，改善重复性。 调节酸碱 加入HCl/NaOH/甲酸水溶液等 N2吹干，复溶 主要在毒品、药物检测中用到，用于浓缩提纯 如脂肪酸跳过这一步是因为物质高挥发性，N2吹干复溶会降低含量 柱前柱后衍化 1.氨基酸: 柱前衍生，先加OPA再加FMOC→荧光检测 2.脂肪酸: KOH-甲醇/乙醇皂化衍生→低沸点易挥发 3.叶酸: 6W紫外灯10cm照射50min→荧光检测 蛋白沉淀 萃取 超滤、有机溶剂或强酸处理，如甲醇、乙腈、三氯醋酸等处理，取上清液使用。 （上清液要保证足够水稀释，以防止组分流失） 适用于极性目标物，如氨基酸、极性衍化后脂肪酸、毒品和部分药物检验。 蛋白沉淀法较固相萃取法简单方便便宜。 内标法 主要在药物检测中用到，赖氨酸、半胱氨酸、乙醇等也需要 如测乙醇时以正丙醇为内标物，以酒精/内标物峰面积比监测血液中酒精含量 pH 衍生条件：氨基酸OPA荧光衍生要求pH10.5，且不能用磺基水杨酸调节 检测条件：叶酸在pH5.4下强度最强 洗脱条件：叶酸pH3.6洗脱才能杂质最少 分离效果与稳定性：调节pH来改变弱酸性弱碱性药物（分子和离子