gus荧光定量分析方法.docx

GUS荧光定量分析方法 、GUS粗蛋白的提取 1、 取拟南芥组织100mg,用液氮研磨成粉。 2、 加入1ml的GUS提取液（pmsf＜蛋白抑制剂 ＞），剧烈震荡。 3、 12000rpm离心10分钟，收集上清液，得到 GUS粗酶提取液。 二、考马斯亮蓝法测定总蛋白含量 1、蛋白含量标准曲线的绘制 0 1 2 3 4 5 6 BSA 溶液 ug/ml 0 3.125 6.26 12.5 25 50 100 反应体积（ul） 40 40 40 40 40 40 40 考马斯亮蓝 G-250溶液（ul） 200 200 200 200 200 200 OD595 OD595平均值 按上表加入不同量的 BSA标准蛋白溶液，测定 OD595的吸光值，并得出曲线方程。 2、样品总蛋白的测定 自定合适的比例的稀释 GUS蛋白溶液，要求稀释后的待测样品颜色介于 1中的0到6之间。 例如：稀释40倍，5ul样品+195ulGus提取液，取40ul +200ulG-250混匀，室温放置2分钟, 测定OD595光吸收值，根据标准曲线计算蛋白含量。 三、GUS活性的测定 1、标准曲线的绘制 终止缓冲液 （mL） 1uM4MU储备液B (ul) 样品浓 度（nM） 荧光值 1 荧光值 2 平均值 2.0 0 0 1.9 100 50 1.8 200 100 1.6 400 200 1.4 600 300 1.2 800 400 1.0 1000 500 用终止液将 MU储备液B按上表稀释成 0-250nM,用荧光计在激发波长为 350nm,发射波长 455nm下测定他们的荧光强度做出一条标准曲线，并得出曲线方程。 2荧光 2荧光 曰. 疋量 1） 取两支Ep离心管，各加入1.8mL反应终止液，并编号. 2） 在Ep管中加入200提取液，加入50uLGUS粗酶提取液，再加入 250ul预热的反应液， 混匀。立即取出200ul加入到1号管中，此反应为0时的样品，荧光测定时以此为空白， 并开始计时。 3） 将反应管放入37摄氏度温箱中进行酶反应， 60分钟后，取200ul反应液，加入到2号 管中混匀，为反应 60分钟时的样品，测定荧光值。 主要溶液的配制： 1、 GUS提取缓冲液： 1) 0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0) 50mL: 0.1M 磷酸钠缓冲液(pH7.0): 557mL0.1mol/LNa2HPO4+42.3mL1mol/L NaH2PO4 定容到1000mL (35.814gNaHPO4.12H2O(358.14)定容到 1000mL;15.6g NaH2PO4.2H2O (156.01)定容 到 100MI) 0.5M Na2EDTA (pH8.0) 2.00mL : 9.31gEDTA 加水剧烈搅拌，加入约 1g NaOH,定容到50 mL. 30%十二烷基肌氨酸钠 0.33 mL : 1.5g加水定容到50 10% Triton X-100 1 mL: 1 mL Triton X-100 力口 9 mL 水混匀 3 -巯基乙醇0.07-0.10 mL (马琳论文里面有) 甲醇 20ml (网上有的文献里有) 蒸馏水定容至 100mL。 2、 考马斯亮蓝溶液 G-250的配制： 100mg考马斯亮蓝溶液 G-250溶于50 mL95%中，力口 100 mL85%磷酸，定容到1 mL, 过滤后保存于 4° C,最终试剂0.01%考马斯亮蓝溶液 G-250,4.7% (w/v )乙醇,8.5% (w/v ) 磷酸. 3、 标准蛋白溶液： 50mg牛血清白蛋白(BSA),溶于50 mL0.15M的氯化钠中。 配制成1 mg/mL的标准蛋 白溶液。 4、 0.15M的氯化钠溶液 0.876g氯化钠定容到 100 mL 5、 4-MU储备液 A (4-MU 1 mM ) : 19.8mg4-MU 溶于100 mL终止缓冲液中, 避光保存 4-MU储备液 B (4-MU 1卩M) : 10卩L4-MU储备液 A定容到10 mL 6、 终止缓冲液(0.2M Na2CO3 ) 10.6g Na2CO3 溶于 500 mL 水。 7、 GUS反应缓冲液： 25mg4-MUG溶于25 mL提取缓冲液中 1mol/L Na2HPO4 溶液：35.814g Na2HPO4 溶于 100ml 水。 1mol/L NaH2PO4 溶液：15.601g NaH2PO4 溶于 100ml 水。 0.1M 磷酸缓冲液(PH7.0) : 1mol/L Na2HPO4 取 5.77ml, 1mol/L NaH2PO4 取 4.23ml ,定 容至100ml。 10% SDS溶液：将90ml水稍微加热，加10g SDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节 PH至7.2,然后加水