RNA pulldown实验（生物素标记的磁珠法）.pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 RNA pulldown 实验 （生物素标记的磁珠法） 1. 实验原理 首先标记 RNA （如生物素探针标记RNA），将其与细胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白 质复合物，分离复合物得到蛋白质，通过蛋白免疫印迹（western blot ）或质谱 （mass spectrometry）检测蛋白。解螺旋 / 2. 实验目的 检测与 RNA （如miRNA、lncRNA）相互作用的未知蛋白 3. 实验材料 3.1. 主要试剂 Pierce RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit （Thermo 20163） DEPC 水 RNase 抑制剂 3.2. 主要仪器 PCR 仪 离心机 3.3. 其他 体外转录的RNA 片段 4. 实验步骤 ① 生物素探针标记RNA 的制备 a)取出 Pierce RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit 试剂盒，打开 PCR 仪； b)用 DEPC 水溶解 RNA，用 DEPC 水溶解试剂盒中 Control RNA 作为阴性对照； c)取对照 RNA、目标RNA 各 5 μl,放于 PCR 管中，每管加 1 μl DMSO，混匀后置于PCR 仪上，85℃ 5min，取出立即置于冰上 5min; d)配制探针标记反应体系： 1 解螺旋 陪伴医生科研成长 成分 体积（ μl） water 3 10X RNA ligase reaction buffer 3 RNase 抑制剂 1 Non-labeled RNA 5 Biotinylated Cytidine Bisphosphate 1 T4 RNA Ligase 2 PEG 30% 15 Total 30 e)混匀，置于 PCR 仪内， 16℃ 过夜； f)取出 PCR 管，向每管中加入 400 μl DEPC 水; g)每管加 300 μl 酚氯仿提取标记成功的 RNA，离心 15min,将上层水相移到新的 EP 管 中。解螺旋 / ②RNA 抽提 a)用 1ml 70%乙醇洗涤,8000rpm 离心 10min,吸净管内液体，空气中晾干 RNA； b)每管加 20 μl DEPC 水溶解 RNA，后将RNA 放于 PCR 仪中，95℃，5min，取出立即置 于冰上备用。 ③细胞裂解 a)弃去培养基，用预冷的PBS 洗 3 次，吸去上清； b)每个培养皿中加入 200μl 细胞裂解液； c)刮下细胞，将细胞悬液收集至EP 管； d)4℃，3000rpm，离心 10min； e)转移上清至新的 EP 管中，置于冰上; f)取 10-20 μl 左右上清至新管中，作为 input 组。 ④磁珠预处理 a)涡旋混匀 beads； b)每管取 400μl beads，置于磁力架上，吸去上清； c)用 800μl 1X binding & washing buffer ,洗 3 次，吸去上清； ⑤RNA 与beads 结合 a)向上一步的beads 中加入400μl 2X binding & washing buffer； b) 向上一步中加入20μl RNA ,再补