核糖体亲和沉淀测序.pdfVIP

解螺旋 陪伴医生科研成长 核糖体亲和沉淀测序 1. 实验原理 为了系统的分析调节因子，我们计划：分别采用核糖体亲和沉淀测序（translating ribosome affinity purification-sequencing, TRAP-seq）和磷酸化核糖体亲和沉淀测序 （pTRAP-seq），比较两者的差异，即可快速分析 XX 刺激前后的基因表达差异，获得被激活 或抑制的基因列表。通过 p-TRAP，进一步验证其与 cFos 共定位率，一般超过 60%认为是激 活或抑制基因。我们计划采用类似的策略来寻找YY 刺激所激活或者抑制基因。 2. 实验目的 寻找特异性激活基因。 3. 实验材料 3.1 主要试剂 Cycloheximide Stock (1000x), DHPC, HEPES,Kcl,MgCl2, DTT, Protease and P’tase Inhibitor Cocktail, RNAsin progmega, Cycloheximide, Superasin，RLT buffer （Qiagen） 等。解螺旋 / 3.2 主要仪器 BEADS, Falcon 管，冰冻离心机，移液器等。 4. 实验步骤 1. Beads 准备，Protein L, + Beads 孵育一小时，PBS 水清洗 30min，+ 抗体孵育一小时。 2. 组织标本匀浆，建议使用玻璃制匀浆搅拌棒，离心（2000xg 4 度 10min），取上清，加 入 NP40 和 DHPC 水，冰上静置 10min，离心20min，去上清为S20（Input），取其中50uL， 加入 RLT buffer （Qiagen），其余加入Beads 中，作为IP。 1 解螺旋 陪伴医生科研成长 3. 提取 RNA 步骤于常规 RNA 提取相似（注意 Qiagen 的Kit 有特殊的洗液，RW1 和 RPF，参 考 Qiagen 的Protocol），建议使用Qiagen 的RNA 离心柱提取。 5.参考文献 1-3 1. Ouwenga R, Lake AM, OBrien D, Mogha A, Dani A, Dougherty JD. Transcriptomic Analysis of Ribosome-Bound mRNA in Cortical Neurites In Vivo. J Neurosci 2017; 37 (36): 8688-705. 2. Thomson SR, Seo SS, Barnes SA, et al. Cell-Type-Specific Translation Profiling Reveals a Novel Strategy for Treating Fragile X Syndrome. Neuron 2017; 95 (3): 550-63 e5. 3. Vragovic K, Bartom E, Savaldi-Goldstein S. Quantitation of Cell Type-Specific Responses to Brassinosteroid by Deep Sequencing of Polysome-Associated Polyadenylated RNA. Methods Mol Biol 2017; 1564: 81-102. 解螺旋 / 2