药品生物检定技术 2.2 浊度法 电子教案-知识点3：浊度法.doc

《药品生物检定》教案 知识点 浊度法 学时 0.5学时 教学内容 浊度法测定的原理、检定的影响因素、浊度法检定方法与操作流程 教学重点 浊度法检定方法与操作流程 教学难点 浊度法检定的影响因素 浊度法操作流程 参考资料 药品生物检定技术 主编：杨元娟 人民卫生出版社 药品生物检定技术 主编：赵卫峰 中国医药科技出版社 药品生物检定技术（第二版）主编：李榆梅 化学工业出版社 药品生物检定 主编：周海钧 人民卫生出版社 一、检定原理 浊度法是利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度的大小比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。 通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑菌效力的方法。 浊度法因在液体中进行，所以不受扩散因素的影响，不会像管碟法那样易受如钢圈的放置、向钢圈内滴液的速度、液面的高低、菌层厚薄等种种因素影响抗生素在琼脂表面扩散，而造成结果的差异或试验的失败。同时本法误差较小，管碟法的可信限率为5%，最大可达7%，而本法在1%—3%；而且可进行自动化测定，易实行规范化操作。 二、菌悬液的制备 1．金黄色葡萄球菌[ Staphylococcus aureus CMCC(B)26 003]悬液 取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35~ 37℃培养20~ 22小时。临用时，用灭菌水或0. 9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 2．大肠埃希菌[ Escherichia coli CMCC( B)44 103]悬液取大肠埃希菌的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35—37℃培养20~ 22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。 3．白色念珠菌悬液[ Candida albicans CMCC( B)98 001] 取白色念珠菌的改良马丁琼脂斜面的新鲜培养物，接种于lOmlⅨ号培养基中，置35—37℃培养8小时，再用Ⅸ号培养基稀释至适宜浓度，备用。 三、检查用溶液的制备 （一）标准品溶液的制备 标准品的使用和保存应照标准品说明书的规定。临用时照各品种项下的规定进行稀释。具体操作是： 1．称量要求同管碟法。 2．稀释标准品与供试品溶液的稀释应采用容量瓶，每步稀释的取样量以不得少于2ml为宜，稀释步骤一般不超过3步。 3．标准品溶液按《中国药典》各品种含量测定项下要求，制成一定浓度的标准品贮备液。在各品种项下规定的剂量反应线性范围内，以线性浓度范围的中间值作为中间浓度。标准品溶液选择5个剂量，剂量间的比例应适宜（通常为1：1. 25或更小）。 （二）供试品溶液的制备 供试品根据估计效价或标示量，按标准品溶液制备方法选择中间浓度，选择至少2个剂量，每一剂量不少于3个试管。 四、含试验菌液体培养基的制备 临用前，取规定的试验菌悬液适量（35~ 37℃培养3~4小时后测定的吸光度在0.3~0.7之间，且剂距为2的相邻剂量间的吸光度差值不小于0.1），加入到各规定的液体培养基中，混合，使在试验条件下能得到满意的剂量一反应关系和适宜的测定浊度。 已接种试验菌的液体培养基应立即使用。 五、检定操作方法 采用标准曲线法进行检定。其步骤为： （一）线性试验 除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各试验管内精密加入含试验菌的液体培养基9. Oml，再分别精密加入各浓度的标准品溶液1.Oml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时）。 （二）样品规定 取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各试管内精密加入含试验菌的液体培养基9. Oml，再分别精密加入2个浓度标准品和供试品溶液各1．Oml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时）。 （三）空白试验 另取2支试管，各加入药品稀释剂1. Oml，再分别加入含试验菌的液体培养基9. Oml。其中一支试管立即加入甲醛溶液0.Sml，混匀，作为空白对照。另一支试管同法培养，作为细菌生长对照。 （四）吸光度的测量 在线测定各管的吸光度。或取出，立即加入12 010甲醛溶液(1_÷3)0.5ml以终止微生物生长，在530或580nm波长处测定各管的吸光度。 （五）记录与计算 1．试验记录要求应包括抗生素的品种、剂型、标示量、生产厂、批号、检查目的、检验依据、检验日期、温度、湿度、标准品与供试品的