凯氏定氮法测定蛋白质的原理以及其消化.docx

精品文档 凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其 消化、蒸馏 以凯氏定氮法测定氮含量换算蛋白质的方法， 是国际上通用的标准方法，操作简单，测定结果重复性和重现性都很 好，广泛用于各种食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测 定。此法又分为常量、半微量、微量法三种。国家标准规定 为半微量凯氏定氮法。其测定原理相同，主要区别在于常量 法的样品及试剂用量较微量法多。 而微量法则具有实验规模 小，实验费用低的优点。但微量法的准确度和精密度比常量 法要差一些。凯氏定氮法整个测定过程分为消解、蒸馏、滴 定三步。凯式定氮法包括消化炉和蒸馏装置，它们的结合能 够让实验尽可能的简单。 要使测定结果有更好的正确度、准确度和精准度，认真细致掌握测定的每个步骤、各个细节及相应的注意事项，就显得尤为重要。 实验过程操作 1、主要试剂的配制 40% 氢氧化钠： 化学纯 400g 氢氧化钠溶于 1000ml 无氨 蒸馏水中。 2% 硼酸：分析纯 20g 硼酸溶于 1000ml 无氨蒸馏水中。 0.05mol/L 盐酸：分析纯 4.2ml 盐酸定容至 1000ml ，通 . 精品文档 过无水碳酸钠标定。 混合指示剂： 把溶解于 95% 乙醇的 0.l% 溴甲酚绿溶液 5 份和溶于 95% 乙醇的 0.l% 甲基红溶液 1 份混合而成 . 2、实验过程注意事项 (1)样品应是均匀的。 固体样品应预先研细混匀， 液体样 品应振摇或搅拌均匀。 固体样品一般取样范围为 0.20g~2.00g; 半固体试样一般 取样范围为 2.00g~5.00g; 液体样品取样 10.0mL~25.0mL( 约 相当氮 30mg~40mg) 。若检测液体样品，结果以 g/100mL 表 示。 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品 应振摇或搅拌均匀。 (2)样品放入定氮瓶内时， 不要沾附颈上。 万一沾附可用 少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低，或者用滤 纸包裹好一起投入消化，滤纸影响通过空白扣除。消化时应 注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底 消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷 却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。 (3)消化时，不要用强火。 若样品含糖高或含脂及较多时， 注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品 损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产 . 精品文档 生。在整个消化过程中保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏 瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使 氮有损失。海能公司消解炉 SH220 或 SH520 能够很好的解 决此问题。 (4)如硫酸缺少， 过多的硫酸钾会引起氨的损失， 这样会 形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗 或样品中脂肪含量过高时， 要增加硫酸的量 ;加入硫酸钾的作 用为增加溶液的沸点 ; 催化剂硫酸铜在有机物全部消化后， 溶 液显清澈透明的蓝绿色，可用它来指示消化终点。此外，硫 酸铜还可用做下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。过氧化氢， 为氧化剂，有助于有机物消化，同时可以消除消化过程中的 气泡现象。 (5)向蒸馏器瓶中加入浓碱时， 往往出现褐色沉淀物， 这 是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经 加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生 成深兰色的结合物 [Cu(NH3)4]2 ，加入氢氧化钠是否足量 , 常常影响整个测定的顺利进行。由反应原理可知，当氢氧化 钠足量时有黑色氧化铜生成而使溶液呈淡黑色 ; 当氢氧化钠 量不足时就无黑色氧化铜产生而使溶液呈淡蓝色， 所以有无 氧化铜颜色存在是判断氢氧化钠是否足量的标志。 (6)因蒸馏时反应室的压力大于大气压力，故可将氨带 出。所以，蒸馏时，蒸气要发生均匀，充足，蒸馏中不得停 . 精品文档 火断气，否则，会发生倒吸。停止蒸馏时，由于反应室外层 的压力突然降低，可使液体倒吸入反应室外层，所以，操作 时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分钟后 关掉热源。蒸馏是否完全，可用精密 PH 试纸测冷凝管口的 冷凝液来测定，中性则说明已蒸馏完全。一般情况下建议使 用半微量法，因为如果蒸馏失败的话，半微量法还可继续蒸 馏，而常量法只好全部重来， 费时费力。我们使用海能 K9840 经过多次蒸馏吸收实验达到理想效果。 (7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色， 在中性溶液中呈灰 色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用 0.1% 甲基红乙醇溶液。 (8)吸收液也可以用 0.01 当量的酸代表硼酸，过剩的酸 液用 0.01N 碱液滴定，而以硼酸为氨的吸收液，可省去标定 碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液 管，操作比较简便。 另外，硼酸吸收液的温度不应超过 40℃，