黄瓜CsPHB基因功能的初步分析.pdfVIP

摘 要 摘 要 HD-ZIP III 类转录因子是高等植物所特有的一类转录因子，调控多种植物细胞的 分化，如分生组织的形成、侧生器官极性的建立、维管组织细胞的分化等。到目前为 止，大多数关于HD-ZIP III 基因的研究都主要集中在拟南芥、水稻和玉米等模式植物 上，而在瓜类作物上的相关报道还很少。课题组通过前期基因的精细定位，鉴定了黄 瓜卷叶突变体的候选基因为CsPHB (PHABULOSA) 。本研究对该基因进行克隆，并构 建植物表达载体，运用农杆菌介导的遗传转化初步验证该基因的功能。主要结果如下： 1. CsPHB 基因调控的黄瓜卷叶突变体表型分析 黄瓜卷叶突变体与野生型相比在不同生育期均有明显差异，突变体纯合子的卷叶 表型更加明显，杂合子属于中间型，说明 CsPHB 存在剂量效应；幼苗期突变体的主 根长和侧根数均显著高于野生型，而株高、茎粗、叶面积和叶周长与野生型相比无显 著差异，在结果期突变体的株高、茎粗、叶面积、叶周长均低于野生型。 2.黄瓜卷叶突变体结果期的茎组织切片观察 通过组织切片观察，发现突变体与野生型茎的基本结构相同，均有9 个大小不同 的双韧维管束；统计500um 的视野下导管直径大于50um 的导管数量，发现突变体的 木质部导管数量比野生型增加了11%。 3.黄瓜卷叶突变体CsPHB 基因过表达载体构建以及在拟南芥中的遗传转化 以黄瓜卷叶突变体的cDNA 为模板，扩增CsPHB 基因的CDS 序列，用无缝克隆 试剂盒构建过表达载体。利用蘸花法将突变体 CsPHB 基因在拟南芥中过表达，获得 T3 代阳性株系，发现 CsPHB 过表达植株茎生叶边缘内卷成筒状，RT-PCR 结果显示 转基因拟南芥 CsPHB-OE 中 CsPHB 基因的表达量显著高于野生型，进一步说明了 CsPHB 是控制卷叶突变体 cuL 的候选基因。对其进行干旱胁迫处理，控水处理 16d 后，CsPHB-OE 拟南芥植株部分叶片干枯发黄，野生型拟南芥植株叶片全部干枯皱缩 死亡，复水后，野生型拟南芥并未改变，而CsPHB-OE 拟南芥植株恢复绿色，正常生 长，表现出明显的抗旱性，说明CsPHB 基因提高了转基因拟南芥的抗旱能力。 4. CsPHB 基因敲除载体的构建以及在黄瓜中的遗传转化 利用农杆菌介导法将突变体 CsPHB 基因在黄瓜上过表达，经过抗性标记基因的 筛选和PCR 鉴定，T 代在 1107 个外植体中获得PCR 阳性株16 株，转化率为 1.4%； 0 利用在线工具CRISPR-P 2.0 进行靶位点的设计，连接载体pKSE401-cas9 ，构建CsPHB 基因敲除载体并进行遗传转化，2959 个外植体中获得基因敲除的PCR 阳性株72 株， 经测序检测，结果发现仅有一株在单靶点附近出现碱基的插入，发生突变。突变植株 I 西北农林科技大学硕士学位论文 生长缓慢，出现畸形叶表型。基因编辑效率仅为0.3‰ 。 关键字：黄瓜；卷叶；CsPHB；遗传转化；抗旱 II 目 录 目 录 摘 要I ABSTRACT III 第一章 文献综述 1 1.1HD-ZIP 转录因子研究进展 1 1.1.1 HD-ZIP Ⅲ转录因子的功能2 1.1.2 PHB 基因的功能4 1.2 植物茎形态解剖结构与抗旱性的关系5 1.3 黄瓜的遗传转化研究进展5 1.3.1 农杆菌介导的黄瓜遗传转化研究进展6 1.3.2 基因编辑相关研究进展 8 1.4 本研究的目的与意义9