circRNA-006258_miR-574-5p_EVI5L对奶山羊乳腺上皮细胞增殖和乳合成调控作用的研究.pdfVIP

摘 要 摘要 泌乳性状是重要的经济性状，乳腺是影响奶山羊泌乳性状的重要泌乳器官，乳腺 的发育和泌乳是乳腺上皮细胞不断增殖、分化与凋亡等生理事件。近年来研究表明， 非编码RNA 广泛参与乳腺发育及泌乳等生理活动，其中包括：miRNA 靶向调控mRNA 的 3’非翻译区；circRNA “海绵” 吸附 miRNA 等。基于实验室前期测序结果发现 miR-574-5p 在奶山羊泌乳高峰期和泌乳前期差异表达，而miR-574-5p 对奶山羊乳腺上 皮细胞具体的分子调控机理尚不清楚。 本试验以关中奶山羊乳腺上皮细胞为研究对象，根据实验室前期测序和软件预测 交叉所得到的 miR-574-5p 靶基因及 circRNA 数据库选定本试验研究的 mRNA 及 circRNA 。本试验通过建立奶山羊乳腺上皮细胞的体外培养体系，运用双荧光素酶报告 系统检测miR-574-5p 与EVI5L 、miR-574-5p 与circRNA-006258 之间的靶向关系；通 过 RT-qPCR 、 Western blot 、 CCK-8 、 EdU 、 细 胞 凋 亡 等 检 测 circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L 对奶山羊乳腺上皮细胞增殖和乳合成的调控作用。 本试验的主要研究结果如下： 1.EVI5L 是miR-574-5p 的靶基因 分别构建EVI5L 野生型和突变型双荧光素酶报告载体，检测双荧光素酶相对活性 可知，EVI5L 的野生型载体显著下调双荧光素酶活性，而突变型载体无明显变化，由 此得出结论，EVI5L 是miR-574-5p 的靶基因；通过RT-qPCR 和WB 试验可知，miR-574-5p mimic 可以降低EVI5L 在mRNA 和蛋白水平的表达，而miR-574-5p inhibitor 使EVI5L 在mRNA 和蛋白水平的表达都显著升高。由此得出结论，EVI5L 是miR-574-5p 的靶基 因并受到miR-574-5p 的抑制。 2.circRNA-006258 通过吸附miR-574-5p 解除其对EVI5L 的抑制作用 将所构circRNA-006258 的野生型和突变型CHECK2 载体与miR-574-5p mimics、 inhibitor、NC 及inhibitor NC 分别共转至GMECs ，双荧光素酶活性检测结果显示，野 生型载体的双荧光酶活性显著降低，突变型载体则无显著性变化；通过合成 si-circRNA-006258 ，将si-circRNA-006258 和NC 分别转染至GMECs 中，通过RT-qPCR、 WB 试验检测EVI5L mRNA 和蛋白水平表达情况，发现si-circRNA-006258 组中EVI5L 的mRNA 和蛋白水平都显著低于NC 组。由此得出结论circRNA-006258 通过海绵吸附 miR-574-5p 解除其对EVI5L 的抑制作用。 3.circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L 调节乳腺上皮细胞增殖及乳合成信号通路 构建EVI5L 的过表达载体，分别合成EVI5L 和circRNA-006258 的干扰RNA ，分 别转染至GMECs ，通过WB 试验，探索circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L 轴调节乳 I 西北农林科技大学硕士学位论文 腺 上 皮 细 胞 增 殖 及 乳 合 成 的 信 号 通 路 。 试 验 结 果 显 示 ， circRNA-006258/miR-574-5p/EVI5L 可以通过 Rab23/ITGB1/TIAM1/Rac1-TGF-β/Smad 通路调节GMECs 的细胞周期，促进其S 期；提高Bcl2 的蛋白表达量，减少Bax 的蛋 白表达，从而调控GMECs 的细胞增殖；激活PI3K/AKT-mTOR 信号通路促进GMECs 中甘油三酯和β-酪蛋白的生成。 综上所述，本试验初步验证了circRNA-006258 作为miR-574-5p 的分子海绵对其 有吸附作用，从而解除miR-