工业淀粉酶的纯化与分析试验报告.docxVIP

工业淀粉酶的纯化与分析 一． 实验目的 1． 掌握盐析法纯化分离蛋白质的工作原理和方法 2． 掌握利用葡萄糖凝胶层析法进行蛋白质脱盐的技术 3． 掌握测定淀粉酶活力的基本原理和方法 4． 学习 Folin- 酚比色法测定蛋白质含量的原理和方法 二． 实验原理 工业淀粉酶含有大量杂质将其溶解浸提后离心， 利用高浓度的硫酸铵溶液将上清液的蛋 白质沉降下来，所得沉淀溶解后即为盐析液。 利用葡糖糖凝胶 G-25 对大分子量蛋白质和小分子盐类的阻滞作用不同，从而经凝胶层 析使盐析液中的蛋白质和盐类分离。 酶活力是以酶在最适条件下， 催化一定化学反应的初速度来表示的。 在本实验中， 是以 一定量的淀粉酶在 37摄氏度，PH=6.8的条件下，每分钟水解淀粉酶生成 1mg还原糖的量为 一个酶活力单位，其中还原糖的量用 DNS法测定。 蛋白质在 Folin- 酚试剂的作用下生成钨蓝和钼蓝，测定其在 500nm 波长下的吸光 度 ，从而求得样品中蛋白质的含量。 三． 实验材料及仪器设备 1． 材料：工业淀粉酶 仪器：电子天平；离心机； UV9100型分光光度计 恒温水域；沸水浴 器材：刻度试管： 25ml*21 ；移液管： 1 ml*6 、5ml*1 ；烧杯： 250ml*2、50ml*1; 研钵：一套；移液枪：一套；离心管： 100ml*1;1.5ml*4;7ml*1; 注射器： 1ml*1 ； 层析装置： 1 套；量筒： 100ml*1 ；洗耳球： 2 个；胶头滴管： 2 个；移液管架； 玻璃棒 实验试剂 BaCl 2 溶液（ 1%） 考马斯亮蓝 G-250 1%NaCl 溶液 淀粉溶液（ 0.5%） 磷酸缓冲液（ 0.2molr/L,pH 6.8 ） NaOH 溶液（ 2.5mol/L ） 牛血清蛋白（BSA标准液（250ug/ml ） Folin- 酚试剂甲 Folin- 酚试剂乙 葡萄糖标准液（ 1mg/ml ） DNS 试剂 实验步骤 浸提 称取 0.317g 淀粉酶制剂， 经浸提离心后转移上清液 1.2ml 于离心管中， 标记为“粗 酶液”备用。记录剩余体积为 18.2ml 并转移到 50ml 烧杯里，置于冰浴中。 盐析按70轴勺饱和浓度称取 6.976g(NH 4)2SQ固体，研细后，缓缓加入离心后的酶液中。 待(NH0 2SQ固体溶解后，冰浴静置 20min后离心，将离心后固体溶解于 4ml蒸馏水 中，并分装于3支1.5ml离心管中，标记“盐析”备用。 脱盐 用洗脱液洗脱柱子，经检验没有残留的盐和蛋白质后 ，对蛋白质进行脱盐。用注射器 注射0.5ml盐析液，上样完毕后，打开出水口，进行洗脱，并收集洗脱液，每管2ml。 分别用BaCh和考马斯亮蓝G-250试剂检验试管中洗脱液的成分。把含有蛋白质的收 集液合并于离心管中，标记“脱盐”备用。 酶活力测定 粗酶液 0.05ml 加蒸馏水 .稀释至 25ml，摇匀待用 盐析液 0.05ml 加蒸馏水 ―k稀释至 25ml，摇匀待用 脱盐液 0.2ml 加蒸馏水 一?稀释至 10ml，摇匀待用 空白 标准葡萄糖浓度梯度 粗酶液 盐析液 脱盐液 0 1 2 3 4 5 A A Bq B1 Cq G 葡糖糖 液(ml) 0.0 0.22 0.4 0.6 0.8 0.9 淀粉酶 液(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 HO(ml) 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.3 pH6.8 缓 冲液 1 1 1 1 1 1 NaOH 溶 液(ml) 1 1 1 预热 摇匀，37 C水浴，5min 预热的 淀粉酶 各1ml迅速摇匀 酶促反 应 37C 水浴，5mi n NaOH 溶 液(ml) 1 1 1 DNS试齐U 各2ml迅速摇匀 显色反 应 沸水浴5min，冷却定容至25ml，摇匀 比色 以0号管为空白参比，测定入-540nm处的吸光度 记录吸 光度 0.000 0.025 0.098 0.191 0.276 0.28 0.172 0.295 0.145 0.493 0.216 0.396 还原糖 (mg) 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 0.900 0.5092 0.9633 0.7408  5 ?蛋白质含量测定 粗酶液0.5ml加蒸馏水 稀释到10ml，摇匀； 盐析液1.0ml加蒸馏水 .稀释到10ml，摇匀； 脱盐液直接取用； 样品处理： 取样 丄芽 研磨水10°；1定容，摇匀 ..浸提 上过滤 取14支试管按下表操作并记录实验数据。 空白 标准蛋白质浓度梯度 样品1 粗酶液 盐析液 脱盐液 0 1 2 3 4 5 A1 A Bi B2 O C2 D D2 BSA标准 液(ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 0.9