含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化用IPTG诱导启动子在大肠.docVIP

含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化 一. 用 IPTG 诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 所需特殊试剂： 1M IPTG 将目的基因与 IPTG 诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的 表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的 LB 平板， 37℃培 养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。 分别挑取对照菌和重组菌 1 个菌落，接种于 1ml 含有相应抗生素的 LB 培养液中， 37℃通气培养过夜。 取 100 微升过夜培养物接种于 5ml 含有相应抗生素的 LB 培养液中（各 10 份），适当的温度（ 20－ 37℃）震荡培养 4 小时，至对数中期（ A550 ＝ 0.1-1.0）。 对照菌和重组菌各取 1ml 未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物 中加入 IPTG 至终浓度分别为 0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5， 5.0mM 相同的温度继续通气培养。 在诱导的 1， 2， 3， 4， 5 个小时取 1ml 样品于 Ep 管中。 细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。 IPTG 的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。 将所有样本室温最高速度离心 1 分钟，弃上清，沉淀重悬于 100 微升 1×SDS 蛋白上样缓冲液中， 100℃加热 5 分钟，室温最高速度离心 1 分钟，取 15 微升样品上样于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶，用 SDS－PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。 . 大量表达靶蛋白 取保存的重组大肠杆菌菌液 150 微升接种于 30 毫升含相应抗生素的 LB 培养液中，在 100 毫升锥形瓶中， 300rpm， 37℃通气过夜培养。 取 16 毫升过夜培养物接种于 800ml 含相应抗生素的 LB 培养液，在 2L 的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度， 300rpm，通气培养 4 小时，至对数生长中期。 以预实验确定的最佳 IPTG 浓度，最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。 收集菌液， 4℃， 5000g（5500rpm）离心 15 分钟收集沉淀，－ 70℃保存。 . 细菌破碎和蛋白质溶解 所需特殊试剂： 非变性裂解液： 50mM NaH 2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM 咪唑， pH8.0 超声破碎液： 50mM NaH 2PO4 ,300 mM Nacl , pH8.0 每 200ml 菌液离心所得沉淀以 10ml 非变性裂解液充分重悬，同时加入蛋白酶抑制剂 PMSF 至终浓度 1mM 。 超声破碎细菌，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间 5 秒，间隙时间 5 秒，总时间 20 分钟（破碎时间一般不宜超过 10 分钟，菌量不超过 1g）。整个超声过程中探头离烧杯底部 1 厘米为佳，烧杯置于冰浴中。 超声破碎后，取 1 滴菌液于载玻片上，烤干后用结晶紫染色观察超声破碎是否完全，大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全可适当延长超声破碎时间。 将细菌破碎液以 10000rpm，30 分钟， 4℃离心，收集上清。用等同于上清体积的超声破碎液重悬沉淀。 分别取 10 微升上清和沉淀重悬液用于 SDS检测，以确定是包涵体表达还是上清表达。其余置于－ 70℃保存。 . Ni-NTA 亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略 （一）若为上清表达 所需特殊试剂： 非变性裂解液： 50mM NaH 2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM 咪唑， pH8.0 Wash buffer: 50mM NaH 2PO4 , 300 mM Nacl ,20 mM 咪唑， pH8.0 Elution buffer: 50mM NaH 2PO4 ,300 mM Nacl ,250mM 咪唑，pH8.0 1. 离心后上清蛋白与 Ni-NTA 混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇 1 小时， 使之充分混匀结合。为了完全去除杂质，离心两次或离心后用 0.4 微米 微孔滤膜过滤。 将混合物转移至层析柱中， 让液体自然流出， 速度可稍慢（ 5－6 秒 /滴），收集流出液体。可以取样进行 SDS，看蛋白挂柱情况。 3. 用 Wash buffer 洗涤层析柱， 洗涤量约为胶体积的 50－100 倍，以便充分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间 可以重复数次。因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。 用 Elution buffer 洗柱，用 1.5mLEP 管收集洗脱液，直至