农用微生物菌剂生产关键技术作业规程NY.docVIP

　 农用微生物菌剂生产技术规程 NY/T 883— ? 1　范围 本规程要求了农用微生物菌剂生产中所包含生产环境、生产车间、菌种、发酵增殖、后处理、包装、储运及质量检验等技术步骤作出要求。 本标准适适用于农用微生物菌剂产品。 2　规范性引用文件 下列文件中条款经过本标准引用而成为本标准条款。通常注日期引用文件，其随即全部修改单（不包含勘误内容）或修订版均不适适用于本标准，然而，激励依据本标准达成协议各方研究是否可使用这些文件最新版本。通常不注日期引用文件，其最新版本适适用于本标准。 GB 3095-1996 ?环境空气质量标准 GB 3838-? 地表水质量标准 3　生产环境及生产车间要求 3.1　生产环境 —— 厂区空气质量达成大气环境质量标准GB 3095-1996中Ⅱ类标准要求； —— 发酵用水达成地表水质量标准GB 3838-中Ⅲ类水质要求，冷却水及其它用水达成标准中Ⅳ类水质要求； 3.2　生产车间 —— 发酵车间和吸附等后处理车间距离合适，相对隔离，有密闭且能够灭菌传输通道； —— 菌种储藏间、无菌操作间和生产车间相对隔离； —— 发酵等生产关键性车间采取双路供电或备用一套发电机。 —— 建立定时用消毒剂进行生产设备和环境消毒车间环境卫生制度。 4　生产技术步骤 农用微生物菌剂通常生产技术步骤为：菌种→种子扩培→发酵培养→后处理→包装→产品质量检验→出厂。步骤图见附录A。 4.1　菌种 4.1.1　原种 原种是生产用菌种母种，对原种要求以下： —— 有菌种判定汇报； —— 菌种企业编号、起源等信息。 4.1.2　菌种保留和管理 —— 采取适宜方法保留菌种，确保无杂菌污染，菌种不退化。应选择一个以上适宜方法保藏，常见菌种类型及对应保藏方法见附录B； —— 分类存放，定时检验； —— 建立菌种档案。 4.1.3　菌种质量控制 在生产之前，应对所用菌种进行检验，确定其纯度和应用性能没有发生退化。出现污染或退化菌种不能作为生产用菌种，需进行4.1.4或4.1.5操作。 4.1.4　菌种纯化 菌种不纯时，应进行纯化。可采取平板划线分离法或稀释分离法，得到纯菌种。必需时可采取显微操作单细胞分离器进行菌种分离纯化。 对纯化菌种应进行生产性能检验。 4.1.5　菌种复壮 菌种发生下列现象之一，应进行菌种复壮： —— 菌体形态及菌落形态发生改变； —— 代谢活性降低，发酵周期改变； —— 关键功效性物质产生能力下降； —— 其它关键特征退化或丧失； 菌种复壮方法：回接到原宿主或原分离环境传代培养，重新分离该菌种。 4.2　发酵增殖 4.2.1　种子扩培 原菌种应连续转接活化至生长旺盛后方可应用。 种子扩培过程包含试管斜面菌种、摇瓶（或固体种子培养瓶）、种子罐发酵（或种子固体发酵）培养三个阶段，操作过程要确保菌种不被污染、生长旺盛。 4.2.2　培养基 培养基关键原料应满足一定质量要求，包含成份、含量、使用期和产地等。对新使用发酵原料需经摇瓶试验或小型发酵罐试验后方可用于发酵生产。 4.2.2.1　种子培养基 种子培养基要确保菌种生长延滞期短，生长旺盛。原料应使用易被菌体吸收利用碳、氮源，且氮源百分比较高，营养丰富完全，有较强pH缓冲能力。最终一级种子培养基关键成份应靠近发酵培养基。 4.2.2.2　发酵培养基 发酵培养基要求接种后菌体生长旺盛，在确保一定菌体（或芽胞、孢子）密度前提下兼顾有效代谢产物。原料应选择起源充足、价格廉价且易于利用营养物质，通常氮源百分比较种子培养基低。 可采取对发酵培养基补料流加方法改善培养基营养组成以达成高产。 4.2.3　灭菌 常见灭菌方法及适用对象见附录C。 4.2.3.1　高压蒸汽灭菌操作要求 a)??? 液体培养基、补料罐（包含消泡剂）、管道、发酵设备及空气过滤系统灭菌温度为121℃~125℃(压力0.103Mpa~ 0.168Mpa)，0.5h~1.0h。液体培养基装料量为50%~75%发酵罐容积。 b)??? 固体培养基物料灭菌温度为121℃~130℃，1.0h ~2.0h；或采取100℃灭菌2h~4h，24h后再灭菌一次。 c)??? 在高温灭菌会产生对菌体生长有害物质或对易受高温破坏物料灭菌时，应采取物料分别灭菌或降低灭菌温度延长时间。 培养基灭菌后按4.2.3.2进行检验。若灭菌不根本，培养基不得使用。 4.2.3.2　灭菌效果检验 采取显微镜染色观察法和/或发酵管试验法检验培养基灭菌效果。 4.2.3.2.1　染色观察法 a)???? 对待检测培养基无菌操作取样，在洁净载玻片上涂片、染色、镜检。 b)???? 若镜检发觉有菌体，即可认为灭菌不根本，需要进行4.2.3.2.2操作，无活菌体后培养基方可使用。 c)???? 若未发觉菌体，初步认为灭菌根本，培养基能够使用。在必需时,可进行4.