外源基因在大肠杆菌中的高效表达.pdf

实验十八 外源基因在大肠杆菌中的高效表达 一、实验目的 1. 掌握外源基因在大肠杆菌中表达的特点和方法。 2. 复习SDS的制备及其分离原理。 二、实验原理 一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一 位于翻译起始密码子5 ’端大约9bp 的SD 序列；位于目的基因3 ’末端的一个 高效转录终止子。此外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活 性进行严紧调节的基因。这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同 的情况加以取舍。E.coli 表达载体的基本结构见下图： 1．有效的转录起始与基因的高效表达 有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键性步骤之一。 最理想的强的可调控的启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧 紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而 引起的细胞死亡等问题。对于原核细胞而言，可分为可诱导型启动子，比如lac， trp，tac，phoA 等，和组成型启动子如T7 噬菌体启动子。 2 ．mRNA 的有效延伸和转录终止与基因的高效表达 转录开始后，mRNA 开始进行有效延伸，终止以及稳定的积累，在这个过 程中，转录物内的衰减和非特异性终止能诱发转录中的 mRNA 分子提前终止。 衰减子位点具有简单终止子的特性，在原核细胞中其处于操纵子的启动子和第一 个结构基因之间，为保证 mRNA 转录安全，在表达载体的组建中要尽量避免其 存在。正常的转录终止子序列的存在也是外源基因高效表达的一个因素，其作用 是防止不必要的转录，使 mRNA 的长度限制到最小，增加表达质粒的稳定性。 对于真核细胞而言，表达载体上含有转录终止序列和 poly A 加入位点，使外源 基因高效表达的重要因素。 3 ．有效的翻译起始与基因的高效表达 在原核细胞中使翻译起始达到最大效率的一般原则：1) AUG(ATG)是最首选 的起始密码子。GUG、UUG、AUU 和AUA 有时也用作起始密码子，但非最佳 选择。2) SD 序列中至少含有AGGAGG 序列中的四个碱基。3) SD 与起始密码 之间的距离以9 ±3 为适宜。4) 在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结 构，使翻译起始调控元件易被核糖体识别和结合。5) 通过突变mRNA 5’非翻 译区的核苷酸序列，减少、去除某些stem-loop 结构可以提高翻译的起始效率。 4 ．遗传密码应用的偏倚性与基因的高效表达 由于核糖体对遗传密码具有选择性，翻译的速度不是恒速的。高表达的基因 经常使用所谓的偏倚性密码。大肠杆菌及其所有的生物的mRNA 中都含主密码 子（偏倚密码）和罕用密码子，关联tRNA 的水平是与相应的密码子的使用频率 成正比的。如果从克隆来的基因含有罕用密码子或其氨基酸组成的分布偏离典型 大肠杆菌的氨基酸分布组成，那么外源基因在表达过程中，由于没有足够的与之 相适应的tRNA ，其蛋白质合成的质和量都受到影响。 5 ．mRNA 序列上终止密码的选择 在大肠杆菌中合成的多肽链的释放由两个释放因子所调控，RF1 识别 UAA 和UAG，而RF2 识别UAA 和UGA。而在真核细胞中也有两个释放因子eRF 。 三个终止密码在终止效率上是不同的，其中UAA 在基因高水平表达中终止效率 最好。在原核细胞中，由于UAA 为两个释放因子所识别，因此在基因合成中， 一般采用UAA 作为终止码。在实际的操作中，为了保证翻译的有效终止，采用 串联的终止密码，而不是一个终止密码。 6 ．外源蛋白的稳定性与基因的高效表达 外源蛋白质表达后是否能在宿主细胞中稳定积累，不被内源蛋白水解酶所降 解，这是基因高效表达的一个重要参数。避免外源蛋白被选择性降解，可采用以 下几种方式：1）融合蛋白的载体部分通过构象的改变，使外源蛋白不被选择性 降解。2 ）产生可分泌的蛋白，如外源基因表达产物可以分泌到大肠杆菌的周质 或者直接分泌到培养基中。3 ）外源蛋白可以在宿主细胞中以包含体的形式表达， 这种不溶的沉淀复合物可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解，以便纯化。4 ） 选择合适的受体表达系统，如选择蛋白水解酶基因缺陷型菌株。受体细胞的选择 是保证外源基因有效表达的最重要的因素之一。 常用表达载体具有以下几种元件： 1. 可控转录的启动子；类型：Plac，Ptac，PT7，PT5，etc