HILIC色谱柱介绍整理.pdfVIP

亲水作用色谱 （HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。本文简介了HILIC 的起源、定 义、分离特点；比较了HILIC 和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC 与质谱联用 技术的特点，并对其使用中的注意事项进行了总结。 1. HILIC 的概念 亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技 术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这 一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。 2. HILIC 的分离机制 HILIC 的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2 ）离子 交换（3 ）偶极-偶极相互作用。更多的试验现象则表明HILIC 的保留机理包含氢键作用、偶 极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。 3.HILIC 影响保留的主要因素 普遍认为 HILIC 保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、 流速、柱温、流动相缓冲体系的pH 值、缓冲盐的种类和浓度。 影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含 量的增加会显著增加样品的保留因子。在 HILIC 分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为： 四氢呋喃丙酮乙腈异丙醇乙醇 甲醇水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。一般采用乙 腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40% 以保证其显著的亲水作用。如图1 所示， 将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保 留就会增强。 Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid. 4. HILIC 与RP-HPLC 的比较 传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流 动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固 定相的反浸润和ESI-MS 灵敏度的下降。 HILIC 正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC 互补的保留方式，能够使在RPLC 上保留较弱或没有保留的物质在HILIC 柱上提供合适的保留，如图2 所示： Figure 2: Chromatograms comparing the retention of allantoin on Atlantis HILIC Silica and Atlantis dC18 columns. (a) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis dC18; mobile phase: 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows no retention (k =0) of allantoin. (b) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis HILIC Silica; mobile phase: 95:5 (v/v) acetonitrile–water containing 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows retention (k =1) of allantoin. 另外，HILIC 柱上的洗脱顺序与RPLC 柱上的正好相反，极性较小的物质先出峰，极性较大 的物质后出峰。如图3 所示： Figure 3. Comparison of ESI+MS response using HILIC and RP conditions. SIR channels of acetylcholine (m/z 146.2) and choline (m/z 103.9); Columns: 100 mm×2.1 mm, 1.7μm (A) ACQUITY UPLC BEH C18 (B) ACQUITY UPLC BEH HILIC. Peaks: 1 = acetylcholine, 2 = choline 5.HILIC 与质谱