HisTag 表达蛋白纯化原理、方法和问题分析整理.pdfVIP

组氨酸标签蛋白的纯化 His-Tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便 而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用 固定金属离子亲和色谱去（IMAC）纯化。 2．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是 Porath et al.1975 年用固定IDA 作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以 吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987 年Smith et al. 发 现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25 作用力更 强，此前在1986 年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25 亲和纯化在氨基 端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987 年Hochuli et al.发现带有相连组 氨酸的多肽和Ni2+-NTA 填料作用力更强于普通的肽，1988 年他第一次用这样的 方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯 化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC 变得非常普遍， 相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋白 配合 IMAC 纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。1986 年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25 可以用于磷酸化蛋白的纯化， 而后发现Ga3+-IDA 也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用 于磷酸化多肽的富集和纯化，同时 IMAC 也可以用于纯化各种和金属离子结合的 多肽，应用非常广泛。 市面常见的商品化IMAC 用于带六个组氨酸标签蛋白的配基有以下几种： 2.2 影响IMAC 纯化结果的因素： 2.2.1 填料的种类： 不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为不 同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有带六 个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。 2.2.2 填料的配基种类、密度、金属离子种类 填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子，哪家产品的颜色越深就意味着和蛋 白的作用力越强，适用范围越广，载量也越高，纯化的好坏关键看纯化的条件， 仅有填料的特异性是不够的，同样配基密度下IDA 填料的亲和力要比NTA 的强， 所以NTA 上不能吸附的样品可以选择IDA 为配基的填料。 螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和镍离子的强，而锌和钴离子的弱。因此如果 一个蛋白作用力强，想得到好的特异性可以选择螯合钴离子，它还有一个优点是 不怕还原剂，特别时候有高浓度的还原剂。相同金属离子，IDA 的强于NTA。螯 合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。同时镍离子是最常用的，如果有条 件可以换不同金属离子以得到更好的效果，因为不同的金属离子有不同的选择 性。因此要希望填料应用范围广就选择镍琼脂糖凝胶，如果是希望特异性好而且 稳定就选择镍NTA 琼脂糖凝胶. 2.2.2 蛋白本身的结构和样品来源 IMAC 原理已经说明只要是带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白都可以被吸 附，所以要想得到好的纯化效果，必须选择好纯化的条件，通常带组氨酸蛋白都 可以在天然情况下被镍琼脂糖凝胶或镍NTA 琼脂糖凝胶吸附，但是如果标签折叠 在蛋白内部不容易暴露，这样就难纯化，如果镍琼脂糖凝胶都不能吸附，可以在 样品和平衡缓冲液中加 1-2M 脲，这样蛋白结构相对松散，也许能吸附而蛋白不 会变性，对于本身就是变性的蛋白如果8M 脲不能吸附，改用6M 盐酸胍溶解样品 就可以被吸附，因为盐酸胍可以打开脲打不开的结构使得标签能暴露。当然如果 有二硫键最好加 1-2mMDTT 也可以更好解决吸附的问题。此外也可以把标签换到 另外一端。 2.2.3 缓冲体系，pH 及盐浓度 对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的的一些缓冲体系，如 Tris-HCl 等，适当提高缓冲液pH 可以增加吸附效果，同样原理可以降低pH 洗 脱一些咪唑洗不去的杂带。为避免由于电荷作用的干扰，平衡缓冲液中需要加 0.1-1M 氯化钠，而在平衡缓冲液添加00.1-0.5%吐温或者triton 可以降低由于 疏水相互作用导致的非特异吸附。 2.2.4 表面活性剂及其他添加剂 添加一些表面活性剂可以增加蛋白的溶解度，降低疏水相互作用，这样使纯 化的结果更好，在实验表明在平衡缓冲液中加 0.5-1%的吐温可以使电泳的背景 更清晰，杂带减少。对一些难溶