兽药检测技术 生物检定定量技术 抗生素微生物检定法（标准）.docVIP

抗生素微生物检定法 本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。 抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。 测定结果经计算所得的效价，如低于估计效价的90％或高于估计效价的110％时，应调整其估计效价，重新试验。 除另有规定外，本法的可信限率不得大于5％。 第一法 管碟法 本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 菌悬液的制备 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液 取枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）悬液 取短小芽孢杆菌（CMCC（B）63 202〕的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液 取金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕或〔ATCC29 213〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）悬液取藤黄微球菌〔CMCC（B）28 001〕的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。 大肠埃希菌（Escherichia coli）悬液 取大肠埃希菌〔CMCC（B）44 103〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。 啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）悬液 取啤酒酵母菌〔ATCC 9763〕的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于IV号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。 肺炎克雷伯菌（Klebosiella pneumoniae）悬液 取肺炎克雷伯菌〔CMCC（B）46 117〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。 支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica）悬液 取支气管炎博德特菌〔CMCC（B）58 403〕的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在32～35℃培养24小时。临用时，用无菌水将菌苔洗下，备用。 标准品溶液的制备 标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。 标准品的品种、分子式及理论计算值见表2。 供试品溶液的制备 精密称（或量）取供试品适量，用各品种项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。 双碟的制备 取直径约90mm，高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基（表l）20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃）加入规定的试验菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm），摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径为6.0mm±0.1mm，高为10.0mm±0.1mm，外径为7.8mm±0.1mm）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。 检定法 二剂量法 取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈直径（或面积），照生物检定统计法（通则1431）中的（2.2）法进行可靠性测验及效价计算。 三剂量法 取照上述方法制备的双碟不得少于6个，在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度（S3）、中浓度（S2）及低浓度（S1）的标准品溶液，其余3个小管中分别滴装相应的高、中、低三种浓度的供试