qPCR实验步骤 (2)整理.pdfVIP

Q-PCR 实验流程 一、 总RNA 抽提 1)细胞培养皿中细胞样品用1X PBS 洗两次后，用1ml 枪将PBS 吸干净，加入1ml Trizol (invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP 管中使细 胞充分裂解，室温静置5min; 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混匀，室温放 置5min 使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称) 2)加入200μl氯仿 （5X），剧烈振荡混匀1min，使水相和有机相充分接触，室 温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序 排好，与第一步的顺序一致) 3) 4℃下，14000g 离心5min，可见分为三层，RNA 在上层水相，移至另一个新 的RNase free EP 管;(用20-200ul 的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面 上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层) 4)沉淀RNA：加入等体积 （1:1）异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8 次)(不应用 振荡器混匀)，室温静置10min; 5)4℃下，14000g 离心15min，收集RNA 沉淀(如离心后仍不见EP 管底部有沉淀， 应将EP 管放置在-80 度冰箱过夜