R-loop介导拟南芥叶绿体基因组稳定性的调控机制研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 R-loop 生物学是近几年广受关注的研究热点，作为基因组上的一种特殊的染 色体结构，R-loop 由一条 RNA:DNA 杂合链和一条单链 DNA 组成。基因组上的 R-loop 结构参与多种生理过程，并影响基因组稳定性，因此R-loop 水平的控制对 基因组稳定性的维持至关重要。尽管大量研究表明R-loop 广泛存在于多个物种中， 但是目前为止在植物叶绿体中的研究还很少。 为了研究R-loop 对叶绿体基因组稳定性影响的分子机制，我们鉴定了一个叶 绿体定位的RNA 核酸酶AtRNH1C ，其可以有效的移除基因组上形成的R-loop 结 构。通过 AtRNH1C 蛋白互作组分析和进一步的研究发现，AtGyrases 可以与 AtRNH1C 互作，移除rDNA 区由于转录复制对撞压力积累的R-loop 结构，维持叶 绿体基因组稳定。这部分工作首次在植物亚细胞器中鉴定和揭示植物是如何通过 控制基因组上R-loop 水平维持基因组稳定性。 为了更好的建立调控 R-loop 水平以维持基因组稳定性的调控网络，我们以 atrnh1c 突变体为模型，寻找参与叶绿体基因组稳定性的维持因子。通过筛选，鉴 定出了一种解旋酶RHON1 。在atrnh1c 突变体中超表达RHON1 可以部分减弱由 于AtRNH1C 基因突变引起的HO-TRCs（Head-On direction Transcription-Replication Conflicts ）区R-loop 积累。进一步研究发现RHON1 可以与叶绿体编码的RNA 聚 合酶（PEP ）互作，RHON1 通过调节PEP 的转录活性，缓解基因组上转录复制对 撞的发生，同时限制和移除叶绿体基因组上形成的R-loop 结构，进而维持基因组 稳定。这部分研究结果表明，RHON1 是另一条与AtRNH1C 途径相平行的R-loop 移除通路。 此外，我们在atrnh1c 突变体的背景下进行EMS 诱变，筛选atrnh1c 黄化表型 的抑制子，寻找叶绿体中参与R-loop 移除的新因子或新途径。目前获得20 几株抑 制子，部分抑制子已经获得了相应的候选基因。 本论文前两部分的工作首次在叶绿体中鉴定了两条R-loop 介导的叶绿体基因 组稳定性维持途径，第三部分的工作将为我们后续筛选新调控因子提供宝贵的资 源。这几部分的工作将为探索植物叶绿体基因组是如何保持其完整性开启了一个 新的研究方向。 关键词：R-loop ；转录复制对撞；叶绿体基因组不稳定性；AtRNH1C ；RHON1 I 目 录 目 录 第1 章 前言 1 1.1 R-loop 生物学 1 1.2 R-loop 的形成 1 1.3 R-loop 的作用 2 1.3.1 R-loop 的积极作用 3 1.3.2 R-loop 的消极作用 7 1.4 R-loop 的消除和抑制 10 1.4.1 RNase H 10 1.4.2 RNA:DNA 杂合链解旋酶（Helicase ）11 1.4.3 RNA 加工因子抑制R-loop 形成 13 1.4.5 其他的R-loop 形成抑制因子 13 1.5 植物中的R-loop 生物学研究 14 1.6 叶绿体 14 1.6.1 叶绿体基因组 15 1.6.2 叶绿体基因的转录 16 1.6.3 叶绿体rRNA 的加工 17 1.6.4 叶绿体基因组的维持 19 1.7 本课题的研究意义 22 第2 章 实验材料与方法 23 2.1 实验材料和生